2013 Fiscal Year Research-status Report
感染細胞指向性の違いにより病原性が異なるサイトメガロウイルスの型判別法開発
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25870580
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
生田 和史 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (60512184)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | サイトメガロウイルス / 単純ヘルペスウイルス / 組換えウイルス |
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| Research Abstract |
異なる２種類の細胞株を用いて患者検体からサイトメガロウイルス（CMV）分離を行い、感染効率が細胞株間で1,000倍の差異を有する2種類のCMVを単一個人より分離した。感染細胞指向性の大きく異なるCMVは異なる病気を起こす可能性がある。現在検査として行われている尿から分離したCMVが、患者に起こっている肺炎やリンパ球増多の原因ウイルス株とは限らないという事実を示唆している。この問題を明らかにするためにも臨床分離株の解析が重要であるが、培養細胞におけるCMV臨床分離株の増殖は極端に悪く、BAC(bacterial artificial chromosome)システム等で組換えウイルスを作成するに必要な大量のウイルスDNAを得られないため、ほとんど研究がなされていない。本研究ではPCR法によりウイルスDNAの全領域を10-20kb毎に増幅し、GENEART high-order genetic assembly system（invitrogen社製）を用いて酵母内でウイルスゲノムとして再構築する。得られたウイルスDNAを細胞に導入し、人工的に作成したウイルスを得る。上皮細胞株で増殖しにくいCMV株を作成し、そこへ増殖しやすいCMV株の断片を挿入した遺伝子組換えウイルスのシリーズを作成する。作成ウイルスが上皮細胞株で増殖しやすくなれば、原因遺伝子はその挿入断片内に存在することが分かる。
本法による大型DNAウイルスの遺伝子組換え株作成系の開発には、実験が容易な単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）をモデルケースとして試行している。我々は感染細胞において表現形質の異なる2株(HSV-1 Fu：細胞融合(fusion)を起こす、Ro：丸くなる(round))を単一個人より分離し、2株それぞれについて8フラグメントを酵母に導入し、大腸菌内で単一化したクローンとして保持した。これらを用いた組換えウイルス作成を試行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大型DNAウイルスの遺伝子組換え株作成系の開発を行うにあたり、ウイルス増殖が速く表現型が明確な2株の単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）をモデルケースとして試行している。2株それぞれについてDNA断片をクローン化し、組換えウイルス作成を試行中であり、研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定通り、HSV-1によってマーカーレスキュー法を確立する。確立手法をもとに、CMVにおける感染細胞指向性決定遺伝子の同定を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
Thermo Scientific NanoDrop(ND-2000)を導入希望していたが、受領金額での購入は難しかったため。
酵母を用いた組換えウイルス作成に必要な専用キットと細胞培養製品を追加購入する予定である。
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[Journal Article] Serological analysis of cytomegalovirus (CMV) subtypes in Japanese healthy pregnant women, mothers and neonates with congenital CMV infection2013
Author(s)
Ikuta K, Minematsu T, Inoue N, Kubo T, Asano K, Ishibashi K, Ishioka K, Sato Y, Imamura T, Nakai H, Yoshikawa T, Moriuchi H, Fujiwara S, Koyano S, Suzutani T.
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Journal Title
J Clin Virol
Volume: 58
Pages: 474-478
DOI
Peer Reviewed
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