2014 Fiscal Year Research-status Report

脂肪肝形成抑制効果を有するいんげん豆抽出物中の生理活性成分の同定と有効性の検証

Research Project

Project/Area Number	25870681
Research Institution	Saitama Medical University
Principal Investigator	瀬尾誠埼玉医科大学, 医学部, 助教 (10406473)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2017-03-31
Keywords	いんげん豆 / リノール酸 / 肝細胞 / 脂肪滴蓄積 / 生理活性成分
Outline of Annual Research Achievements	平成 26 年度は、前年度に引き続き in vitro 脂肪肝形成モデルに対して顕著な抑制効果を示したいんげん豆抽出物中の生理活性成分を含む分画を得るための検討を行った。クルードないんげん豆抽出物は、従来通り乾燥いんげん豆をミルで破砕し、含水エタノールで一晩静置した後、上清をフィルター濾過して調製した。この抽出物に含まれるエタノールをエバポレーターで留去後、前年度同様固相抽出による分画作製と限外濾過法によるペプチド成分の分画作製を行った。固相抽出ではでコンディショニングしたカートリッジにいんげん豆抽出物を添加し、蒸留水で洗浄した洗浄液を水抽出物として分取した。複数の有機溶媒それぞれを 10%, 30%, 60%, 90% の抽出液にて溶出した分画を濾過滅菌した。これらと別に限外濾過法では 3,000, 5000, 10,000, 30,000 kDa カットオフの各カートリッジでペプチドの分画を分子量ごとに細かく抽出した分画を濾過滅菌した。各分画における脂肪肝形成に対する改善効果の評価は、ヒト初代培養肝細胞を用いた in vitro 脂肪肝形成モデルを用いた。すなわち、ヒト初代培養肝細胞に、高濃度長鎖脂肪酸を添加するのと同時に各分画を添加し、24 時間後に Oil Red O 染色して細胞内への脂肪滴蓄積の程度を形態学的に評価した。また別に各処置を行った細胞を Oil Red O 染色した後、 100% イソプロパノールで色素抽出して吸光度 (測定波長 490nm) を測定し、その数値の減少を脂肪滴の減少の指標として、脂肪滴蓄積の程度を併せて評価した。また顕著な脂肪滴蓄積抑制効果が認められた分画に関しては、脂質抽出を行い細胞内脂質濃度 (中性脂肪、コレステロールなど) の測定を行った。その結果、固相抽出により得た分画において改善効果が認められたものがいくつかあり、細胞内脂質濃度も低下していた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 平成 26 年度は、クルードないんげん豆抽出物から各種抽出法によりケミカル成分またはペプチド成分の分画を作製し、脂肪滴蓄積に対して顕著な改善効果を評価できる分画を得て、顕著な脂肪滴蓄積抑制効果のある分画から活性成分を同定することを目標としてきた。現在までのところ、脂肪滴蓄積を抑制することが期待できるいんげん豆の分画としては、固相抽出した分画に複数見出すことができた。しかし、活性成分の同定まではできていないことから、早急に LC-MS などによる機器分析を行う必要があることから達成度としてはやや遅れていると評価した。
Strategy for Future Research Activity	平成 27 年度より研究代表者の所属が埼玉医科大学医学部基礎医学部門生化学から福山大学薬学部薬学科に異動となったため、平成 27 年度は異動先の福山大学での研究環境のセットアップが必要となるため研究の進行度に遅れがでる可能性が高いのであるが、埼玉医科大学では老朽化のため利用できなかった NMR などの分析機器が福山大学では常時稼働しているため、いんげん豆抽出物中の活性成分の同定の進展が期待できる。動物実験では、 in vitro 実験で最も効果の高いと考えられる活性成分 1 つに焦点を絞ることにより、研究期間内に予定していた研究項目を遂行できるよう尽力する。
Causes of Carryover	平成 26 年度後半に研究代表者が埼玉医科大学から福山大学に異動することが決定したため、年度途中から研究の進行度を抑え、埼玉医科大学在職中に使用する研究用消耗品や備品類を購入することを控えたため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	繰り越した平成 26 年度までの研究費は、細胞培養関連用品 (培地、血清、培養器具など) や分画作製・精製をすすめるためのカラム・分画用担体などの購入に充てる。また単離した活性成分の同定に関しては、外注による LC-MS 分析も視野に入れて研究を加速させるとともに、年度内に動物実験を行えるよう尽力する。