2013 Fiscal Year Research-status Report

ALSモデルマウス病態悪化過程の１細胞イメージングから行う細胞死の解明

Research Project

Project/Area Number	25870754
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	原央子東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (40528452)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	筋委縮性側索硬化症 / 前頭側頭変性症 / モデルマウス / 神経変性疾患
Research Abstract	病態の指標とされ細胞死につながる異常な変化と捉えられている凝集体の存在は、患者組織切片などにより調べられてきたが未解明な事象も多いとされる。「凝集体」が細胞へ与える影響を調べる目的で本研究を行っている。具体的に本研究では、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭変性症(FTLD)のモデルマウス(変異型TDP-43ノックインマウス)を材料とし、「ALSモデルマウス病態変化過程の１細胞イメージングから行う細胞死の解明」と目的を位置づけ、凝集体形成と神経細胞死との時間軸の解明を目指している。本年度の研究では、[課題１]として、培養デッシュにおいて細胞内凝集体に起因するニューロン死を再現することを目標とした。この検討では、凝集体形成が起こったニューロンを追跡しつづけるところが困難であり、凝集体形成と細胞死とを一連の現象として捉えるまでには至らなかった。そこで、ALSモデルマウスの脊髄組織切片より、細胞死の有無を調べる検討に立ち戻った。脳から脊髄を16ブロックに分け、4か月齢と8か月齢のモデルマウス4匹ずつの切片を作製し、HE染色と神経特殊染色(KB染色、bodian染色)を行い観察したところ、野生型とALSモデルマウス2種類との間で、優位な脊髄前角の神経細胞死が検出はなく、現在、神経変性が起こる時期について蛍光抗体染色(anti-TDP-C, anti-Ub, anti-Lamin)により調べている。この検討により、神経変性の始まる時期と凝集体形成の時期を検索しているところであり、改めてライブイメージングにより時間軸を調べる計画である。[課題2]として、in vitro ニューロン死カスケードの開始を知らせるプローブ開発とイメージングを目標とした。プローブ開発に成功した。引き続きイメージングを進めていく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 今年度の研究において脳脊髄切片作製へと展開したこともあり、ヒトALSで確定診断に用いられるブニナ小体が本研究のALSモデルマウスにも存在するかという検索も行ったところ、8か月齢のALSモデルマウスにおいて、HE染色にブニナ小体像が観られ、同検体においてブニナ小体であることを裏付けるシスタチンC染色も陽性であった。またこのブニナ小体は複数のALSモデルマウス脊髄において観られた。本研究で検索に成功したブニナ小体は、他のALSモデルマウスにおいて発見されたという報告は現在のところない。本研究で用いているマウスが、発症後にブニナ小体が出現するALSモデルマウスだ、ということを結論づけられたことは大きな成果である。この成果もあり、現在、この内容を含めて論文執筆中であることから、当初の計画とはまた別の観点ではあるが本研究は本年度大きく進展したと考える。また、遅発性の神経疾患において、発症までそして発症後も飼育し続けられることが研究を進めるうえで非常に重要である。本研究では、実験の都合もありALSモデルマウスの飼育を３つの施設で同時進行に続けてきたところ、離れた３カ所において同様の表現型が得られているとわかった。これは、作製し使用しているALSモデルマウスが環境が異なっても安定して病気を発症することを意味する情報であると言える。中でも、7か月齢以上のマウスケージでは、野生型とモデルマウスとの区別が一見して明らかなほど、体重増加速度減少の症状が出現していた。この結果は、本研究計画において平成26年度以降の研究計画とした課題の、in vitroニューロン死カスケードの開始を知らせるプローブ開発とイメージングの項目において、イメージングに適した時期を決定するために非常な情報である。研究の過程でこの情報を得られたことも本研究の今年度の成果である。
Strategy for Future Research Activity	培養デッシュにおいて変異型TDP-43の細胞内凝集体形成からニューロン死までの再現が本年度の計画で実現途中の項目である。ALSモデルマウスの脊髄運動ニューロンの培養に成功し、細胞内でTDP-43を追跡する方法の構築まで達成しているので、ニューロン死の再現を行っていく。そのために来年度も引き続きALSモデルマウスの飼育、初代培養の試薬、細胞イメージングシステムの改良等にも研究資金と時間を費やす方針である。また、ニューロン死の理由をより詳細に解明するためには、現在行っている変異型TDP-43を発現するニューロン自身の細胞死の過程を追跡する手法に加え、最近に学会や論文で報告され注目されている凝集体の細胞間伝播、すなわちプリオン仮説についても新たに検討開始する必要がある。来年度以降の研究計画において、関連領域の昨今の研究動向に合わせて変異型TDP-43凝集体の細胞間伝播にも着目し、それらの研究を盛り込んだ研究計画として進めていくべきと考えている。本研究で構築している培養デッシュでの生細胞イメージングを用いれば、伝播の観察も同時または平行して可能である。研究計画を大きく変えずに効率よく現象を捉えられるはずである。また来年度は、ALSモデルマウスの生体イメージング(26年度以降[課題2])に向けた準備を始める時期である。本研究代表者の動物飼育施設が非常に混雑しているという飼育室の事情により、縮小して少ない匹数で行うことも予想される。そのため、事前検討を慎重に行った上で、効率よく結果を得るために多少の研究計画の変更の可能性がある。このことについては来年度研究計画をするときに改めて検討したい。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	研究計画当初に購入を予定していた吸光マイクロプレートリーダーを施設内の他研究施設で借りることができるとわかったため購入をとりやめたので、次年度使用額が生じた。その購入予定機器の価格の約半分を今年度の消耗品代として培養試薬や遺伝子工学用試薬を購入した。来年度は、実験計画の追加、試薬や消耗品の価格上昇、4月からの消費税導入、により本研究の全体的な支出増額が見込まれる。本年度使わずに残した資金を来年度の消耗品代(培養用試薬、遺伝子工学用試薬、顕微鏡部品費用)と予定している。