2015 Fiscal Year Annual Research Report
核プロテオミクス分析法の開発と蛋白質ネットワークの解明
Project/Area Number |
25870798
|
Research Institution | Musashino University |
Principal Investigator |
一番ヶ瀬 智子 武蔵野大学, 薬学研究所, 客員講師 (40453956)
|
Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
Keywords | 核タンパク質 / プロテオーム解析 / 抽出再現性 / 高速液体クロマトグラフィー |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究では申請者らが開発したプロテオーム解析法を用いて活性酸素であるスーパーオキシドアニオンの消去酵素スーパーオキシドジスムターゼ1を欠損した細胞の核プロテオミクス分析法の開発を行い、スーパーオキシドアニオンの核内への影響を明らかにすることを目的とする。研究は当初順調に進行していたが、前々年度の結果から、取り扱う細胞(ニワトリ DT40 細胞)の核膜が極めて脆弱であると判明し、再現性のある核タンパク質の回収が困難であった。そこで前年度は研究計画を変更し、核抽出タンパク質の新規濃縮方法の開発を行った。具体的には、核をキットプロトコール通りに抽出後、ロート管状の筒にポリアクリルアミドゲルを充填したゲルを、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の原理で濃縮する手法である。条件の最適化後、BSAで濃縮操作の再現性を確認できた(日間 RSD<25%)が、複数のタンパク質が含まれる状態で試料をゲルに添加すると回収部分に詰りが生じ、濃縮タンパク質をひとつの分画で再現良く回収できなかった。そこで、本年度は上記濃縮操作の導入を断念し、抽出法の改善を行った。具体的には、抽出前の細胞の状態や、抽出スケール、インキュベーション時間などを最適化した。その結果、核抽出前の細胞を冷凍保存しないこと、抽出に用いる細胞数を1/10減らし、15 mL遠沈管から 1.5 mLチューブで一連の抽出を行うこと、60 minインキュベーションすることとした。その結果、核タンパク質の種類に関しては、再現良く抽出を行うことが可能となった。また、nano-HPLC/MS/MSで抽出タンパク質の同定を行ったところ、histone H3-IVやheterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1など多くの核内タンパク質が確認でき、細胞質成分の汚染を受けることなく核抽出できた。
|
Research Products
(3 results)