microRNA解析を用いた骨肉腫の薬剤奏効性予測バイオマーカーの開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25871161
• Research Institution: National Cancer Center Japan
• Principal Investigator: 窪田 大介 独立行政法人国立がん研究センター, 中央病院, がん専門修練医 (70638197)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 骨肉腫 / 化学療法奏効性 / マイクロRNA / バイオマーカー

Outline of Annual Research Achievements

背景：骨肉腫は小児に好発する原発性悪性骨腫瘍である。骨肉腫においては、化学療法の奏効性が予後を規定する因子として重要である。治療開始前に奏効性を予測できれば、化学療法の個別化や最適化が可能となる。そこで今回我々はmiRNAに注目し、治療開始前に化学療法奏効性を予測するバイオマーカーの開発を行った。
方法：8症例の治療開始前の骨肉腫切開生検検体（奏効4症例、抵抗4症例）を用い、2群間のmiRNAプロファイルをマイクロアレイを用いて比較検討した。発現差を認めたmiRNAに関しては、骨肉腫細胞株にmiRNAを細胞内導入し、そのメカニズムを検討した。
結果：マイクロアレイによる発現解析の結果、2群間で6個のmiRNAに有意な発現差を認めた(p＜0.05)。この中でも最も差が顕著であった2種のmiRNAについて機能解析を行った。骨肉腫細胞株にmiRNAを導入し、高発現させると、MTX,DOX,CDDPのいずれに対しても薬剤抵抗性を増大させた。またMTSアッセイ・Cell Invasion Assayでは、これらのmiRNAが細胞増殖・細胞浸潤を促進した。
次にmiRNAがどのmRNAを標的として作用するかを検討した。miRNAのデータベースを使用し、これらのmiRNAがアポトーシス・細胞周期を調節する分子(TP53, Rb)を制御することにより薬剤抵抗性に寄与する事を確認した。更にタンパク質プロファイルの変化について、質量分析を用いたGELC-MS法で解析し、細胞周期に関わるタンパク質のプロファイルが変化することを確認した。さらに追加の20症例の臨床検体を用いて発現検証を行った結果、これらのmiRNAは化学療法奏効性の強く相関する事を明らかとした。
結論：骨肉腫の化学療法奏効性に関わるmiRNAを同定し、また機能解析によりmiRNAと化学療法奏効性のメカニズムを明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は骨肉腫の化学療法奏効性に関わるmiRNAの機能解析およびパラフィン検体を用いた発現検証を行なった。
これまでに骨肉腫細胞株を用いて、miRNAの導入を行い、その前後での遺伝子発現プロファイルの変化をプロテオーム解析・トランスクリプトーム解析を用いて解析してきた。in vitroでの機能解析では発見したmiRNAが細胞増殖能、浸潤能、化学療法奏効性に関わる事を明らかとした。またそのメカニズムが細胞周期に関わるP53やRb遺伝子を標的としていた。今年度からはin vivoレベルでの機能解析の準備を進めている。昨年度末からは骨肉腫細胞株に恒常的にmiRNAを高発現させるベクターの導入を試みたが、安定した導入が困難であった。miRNAは非常に小さな塩基数のヌクレオチドであることが原因と考えられた。現在は、LNA microRNA inhibitorを用いた動物実験の系の樹立を行っている。in vivoの研究では、主にマウスの皮下に腫瘍を移植し、腫瘍径を計測することで、生体内での腫瘍増殖能を評価する予定である。またその背景として、細胞増殖やアポトーシスについての調査を行う
臨床検体における発現解析については、パラフィン固定された検体からmiRNAの抽出を行い、qRT-PCR法を用いて、標的とするmiRNAの発現量を調査した。当院で治療された20症例の骨肉腫症例におけるmiRNA発現を調べたところ、いずれのmiRNAも治療抵抗症例において高発現していた。バイオマーカーの臨床応用を目指すにあたっては、さらに症例数を増やして検証する必要があり、現在その準備を進めている。

Strategy for Future Research Activity

in vivoにおける機能解析については、ベクターを組み込んだ当該miRNAの恒常発現が困難であったため、LNA microRNA inhibitorを用いた発現抑制系の樹立に変更した。現在、LNA miRNA inhibitorを用いたマウスモデルの作成に着手しており、今年度は生体内におけるmiRNAの機能についての調査を調べていく。また、臨床検体におけるmiRNAの発現検証をすすめるため、さらに症例数を増やす予定である。発現検証にはパラフィン固定の検体を用い、qRT-PCRにてmiRNAの発現を検証し、統計解析で化学療法奏効性との関連を調査する。また化学療法後のパラフィン検体も使用可能となっており、化学療法後にmiRNA発現がどのように変化するかも調査していく予定である。

Causes of Carryover

見したmiRNAの生体内での機能を検証するための動物モデルの作成を目指し、標的のmiRNAをベクターに組み込んで恒常的に発現する骨肉腫細胞株の作成を試みたが困難であった。そのため、実際の動物実験用の費用に未使用額が発生した。現在、LNA miRNA inhibitorを用いた発現抑制系の細胞株作成の目処がついたため、研究機関を１年間延長させていただき、引き続きin vivoでの機能検証を進めさせていただきたい。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度使用額については、主に動物実験と臨床検体の検証実験に使用させて頂きたい。動物実験は実験動物、miRNA発現抑制のためのLNA miRNA inhibitor、各種抗がん剤などの費用として、臨床検体の検証実験としては、サンプルの用意に伴う消耗品、miRNA抽出、PCRプライマーと試薬の費用として使用する予定である。また研究成果を発表するための論文作成費用、学会発表に伴う費用にも使用する予定である。