活性酸素により活性化するATMキナーゼのシグナル伝達経路の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25871242
• Research Institution: 独立行政法人医薬基盤研究所
• Principal Investigator: 橋口 一成 独立行政法人医薬基盤研究所, 創薬基盤研究部, 特任研究員 (80400414)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: ATM / キナーゼ / リン酸化 / シグナル伝達 / 活性酸素 / 酸化ストレス

Outline of Annual Research Achievements

これまで、ATMタンパク質はDNA損傷に応答して活性化するリン酸化酵素（キナーゼ）の一つであるとされていたが、DNA損傷非依存的に活性酸素によっても活性化することや、2種の活性型ATMの基質に違いがあることが示唆されているが、活性酸素応答リン酸化ATMの下流シグナルについてはほとんど明らかにされていなかった。そこで活性酸素依存的（DNA損傷非依存的）に活性化するATMのシグナル伝達経路を明らかにするために、まずは抗体を用いたATM特異的な基質の検出を行った。本研究ではヒト培養細胞株からATM欠損細胞株を樹立し、ATMキナーゼの基質のリン酸化検出を、ATMリン酸化モチーフに対する複数のモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析により行った。0.01 mg/mL ブレオマイシン処理（DNA損傷誘発）ではATM（自己リン酸化）、Chk2（ATM基質）及びH2AX（DNA二本鎖切断マーカー）のリン酸化が、0.25 mM過酸化水素処理（酸化ストレス付与）ではATM及びChk2のみのリン酸化が期待された通りに観られた。この条件下で、過酸化水素処理ではブレオマイシン処理と比較して、有意に少ないATM基質のリン酸化が検出され、さらに過酸化水素処理時のみに観られるATM基質の検出に成功した。またこれらのATM基質のリン酸化は、遺伝子破壊細胞株を用いることでATM特異的なものであることが確認された。以上の成果から、DNA損傷応答時と活性酸素応答時でのATM活性化経路が異なることが明白となった。今後は、本研究で樹立した遺伝子破壊株を用いたリン酸化プロテオーム解析を通して、各リン酸化部位の質的・量的変動を網羅的に解析すること、さらに全プロテオーム解析により、遺伝子発現変動を網羅的に観ることで、ATMキナーゼが関与するシグナル経路が明らかになることが大いに期待できる。