2014 Fiscal Year Annual Research Report
In Vitro再構成系を用いた植物マイクロRNA生成機構の解析
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25892025
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
岩田 雄二 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (80704965)
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| Project Period (FY) |
2013-08-30 – 2015-03-31
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| Keywords | microRNA / シロイヌナズナ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シロイヌナズナを用いた遺伝学的解析から、microRNA（miRNA）生成に関与するタンパク質が多く同定されている。そのうち、RNAの5'キャップ構造に結合するタンパク質複合体Cap Binding Complex（CBC）について、昨年度に引き続き精製タンパク質の調製を試みた。大腸菌発現系を用いて様々な発現条件を試みた結果、N末端にヒスタグを付加したCBP80と、N末端にヒスタグ、C末端にストレプタグを付加したCBP20を共発現させた時にCBP80とCBP20両方のタンパク質を可溶化状態で精製することができた。また、CBP80とCBP20は1対1で安定的な複合体を形成していることが示唆された。
次に、昆虫細胞／バキュロウイルス発現系を用いて、シロイヌナズナDicer-Like1（DCL1）タンパク質を調製した。基質となるmiRNA前駆体として、5’末端にキャップ構造を付加したpri-miR167bを調製し、in vitroプロセシング反応に供した。その結果、DCL1によりpri-miR167bが切断されmiRNA/miRNA*が生成された。精製CBCを加え同様の反応を行ったがpri-miR167b切断やmiRNA/miRNA*生成の促進は見られなかった。この結果から、DCL1以外のタンパク質がCBCと協調してmiRNA前駆体プロセシングに機能している可能性が示唆された。今後、in vitroにおけるCBCの機能を明らかにするには、HYL1やSEなど、miRNA生成に関与する遺伝子をコードするタンパク質を実験系に加えることが必要であると考えられた。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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