重症遺伝性赤血球異常症の治療モデルとしてのPK異常症への遺伝子治療法の検討

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25893164
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 鶴田 敏久 九州大学, 大学病院, 講師 (70197771)
• Project Period (FY): 2013-08-30 – 2015-03-31
• Keywords: 遺伝子治療 / 赤血球異常 / 造血幹細胞 / iPS細胞

Outline of Annual Research Achievements

ピルビン酸キナーゼ異常症(PKD）に対する新規遺伝子治療法の開発に向けて、PKD疾患モデルマウス、及び細胞治療に供するPKDマウス由来iPS（PKD-iPS）細胞の有用性を検討した。これまでの研究で、野生型マウス線維芽細胞にレトロウイルスベクターによって山中4因子を用いて誘導したiPS細胞について、血球細胞への分化誘導を行い、血球系細胞の前駆細胞様細胞を得ることができた。今回我々は、PKD疾患モデル（PK-1）マウスの確認、PKD-iPS細胞の樹立と赤血球への分化誘導及びゲノム編集のためのベクターの構築を試みた。
まず、PK-1マウスの表現型を解析した。野生型マウスでは見られないDNA変異をPK-1マウスで認めた。また4週齢と8週齢マウスを用いて血中赤血球数を測定したところ、4週齢の時点で野生型マウスに比べ有意な赤血球数の減少を認めた。さらに脾臓を比較すると、PK-1マウスの脾臓は野生型に比べ肥大しており、HE染色により、溶血が起こっている様子が観察できた。赤血球の分化に関しては、野生型マウスでは成熟赤血球が多く、PK-1マウスでは未熟な赤血球が多かった。
次に、樹立したPKD-iPS細胞についてDNA変異を確認したところ、マウスで確認されたDNA変異をPKD-iPS細胞でも認めた。このPKD-iPS細胞を適切な培養環境で赤血球に分化誘導したところ、FACS解析及びギムザ染色により赤血球に分化誘導可能であったが、その数は野生型に比べて減少傾向にあることが明らかとなった。
さらに、ゲノム変異PKLR遺伝子の修復に用いるガイドRNA/Cas9発現ベクター及び遺伝子修復用ドナーベクターを構築した。これらのベクターをiPS細胞に導入するための条件検討を行い、ゲノム編集に必要とされる遺伝子導入効率40%を上回る導入効率（50%）を実現した。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。