フォワードジェネティクスで同定した新規睡眠制御遺伝子による睡眠覚醒制御機構の解明

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26220207
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 柳沢 正史 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授 (20202369)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上田 壮志 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (00599821) ; 高橋 智 筑波大学, 医学医療系, 教授 (50271896) ; 船戸 弘正 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授(WPI-IIIS) (90363118) ; Liu Qinghua 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授 (90723792)
• Project Period (FY): 2014-05-30 – 2019-03-31
• Keywords: 睡眠 / マウス遺伝学 / 神経生理学 / 生化学

Outline of Annual Research Achievements

1.リン酸化酵素SIK3の変異による睡眠量の増大と、明瞭な系統学的保存性。Sik3変異はエクソンをスキップするスプライス変異となる。スキップするエクソンがコードする52アミノ酸は脊椎動物間でよく保存されいる。この中には、ショウジョウバエや線虫でも保存されているPKAリン酸化部位が存在する。PKAリン酸化部位のセリンをアラニンに置換したSIK3を強制的に発現誘導させたところ、ショウジョウバエの睡眠様行動が延長した。
2. CRISPR法を用いたNalcn遺伝子改変マウスの作成と解析。同定したNalcn遺伝子変異のレム睡眠異常への因果性を証明するため、CRISPR法を用いて、Dreamless変異マウスに見出された1塩基変異をNalcn遺伝子に導入した。その結果、Dreamless変異マウスのレム睡眠短縮を再現することができた。
3. パッチクランプ法によるNalcn遺伝子変異神経の解析。Dreamless変異によるNALCN機能の変化を検討するために、野生型およびDreamless変異型のNALCNをHEK293細胞に発現させ、パッチクランプ法による電気生理学的な解析を行った。変異型NALCNは野生型に比べて顕著にイオン透過性が高まっていた。イオン選択性に乏しい点や膜電位非依存性である点については、野生型と同様であった。Dreamless変異マウス脳におけるレム睡眠制御神経の活動変化を明らかにすることが必須である。レム睡眠を抑制することが知られている中脳網様体のdeep mesencephalic nucleusをスライスパッチ法にて解析した。野生型に比べて、Dreamless変異マウスは記録中の平均膜電位が高く、発火頻度も高かった。レム睡眠エピソードの終止に関わる神経細胞群が過剰に活動するために、レム睡眠エピソードが短縮し、ひいては全レム睡眠時間が減少することを示唆している。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

以下の、当初研究に挙げたすべての項目について、現時点で順調に進展しており、いくつかの目標については予定以上のスピードで、または予想以上にインパクトのある結果が得られている。研究成果の一部は、昨年NATURE誌に掲載された論文にて公表した。
１ Sik3遺伝子変異マウスを用いた睡眠覚醒制御の細胞内シグナル伝達系の解明。FLAGタグを挿入した野生型および変異型SIK3ノックインマウスを作製しており、SIK3自身のリン酸化部位の定量的評価を行い、NATURE誌論文中にて公表した。これは当初の計画を超える研究の進展と言える。Sik3遺伝子変異マウス脳を用いたプロテオミクス、リン酸化プロテオミクス研究を実施し、現在投稿中である。
２ CRISPR法を用いたNalcn遺伝子改変マウスの作成と解析を目指して、Nalcn遺伝子にDreamless変異を導入したマウスを作製し、睡眠覚醒行動を評価した。このことにより、Nalcn遺伝子の変異によってレム睡眠短縮が生じることを証明しNATURE誌論文中にて公表した。
３ パッチクランプ法によるNalcn遺伝子変異マウス脳の解析。パッチクランプ法による、培養細胞を用いた野生型および変異型NALCNの解析を行った。また、レム睡眠を制御する中脳網様体内の神経核をターゲットに、野生型およびDreamless変異マウスのスライスパッチクランプ法による電気生理学的検討を行った。この結果は、NATURE誌に発表した。

Strategy for Future Research Activity

１．Sik3遺伝子改変マウスを用いた睡眠覚醒制御を司る神経回路の同定。Sik3 Ex13 floxマウスは、Cre依存的にExon13がスキップし、Sik3変異マウスと同様の覚醒時間の減少を示すかどうかを検討するために、全身的にCreを発現するAyu1-Creマウスと交配させた。得られたAyu1-Cre;Sik3 Ex13 floxマウスは、期待通りにEx13をスキップすることをゲノムDNA、mRNAおよび蛋白質レベルで確認した。このマウスの睡眠覚醒を検討したところ、Sik3変異マウスと同様の、顕著な覚醒時間の短縮を認めた。現在、Vglut1-Cre, Vglut2-Cre, Vgat-Cre, TH-Cre, CamKII-Cre, ChAT-Creとの交配を進め、睡眠覚醒のデータも得られている。インパクトのある研究成果とするため、脳領域特異的なCreドライバーとの交配を進める。研究期間内での発表を予定している。
２．Sik3遺伝子変異マウスを用いた睡眠覚醒制御の細胞内シグナル伝達系の解明
プロテオミクス、リン酸化プロテオミクス研究は、現在投稿中である。この研究を通じて、睡眠覚醒を制御する新しい候補蛋白質も得られているため、新たな研究計画を提案していく。
３．パッチクランプ法によるNalcn遺伝子変異マウス脳の解析
さらに研究を発展させるために、NALCNの開口に関わる機構の解明を目指している。サブスタンスPなどのGPCRを介したシグナルによる制御を中心に検討を進める。

Research Products

• [Journal Article] Anatomical and electrophysiological development of the hypothalamic orexin neurons from embryos to neonates (2017)
  • Author(s): Ogawa Y, Kanda T, Vogt K, Yanagisawa M.
  • Journal Title: J. Comp. Neurol. in press Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A non-peptide orexin type-2 receptor agonist ameliorates narcolepsy-cataplexy symptoms in mouse models (2017)
  • Author(s): Irukayama-Tomobe Y, Ogawa Y, Tominaga H, Ishikawa Y, Hosokawa N, Ambai S, Kawabe Y, Uchida S, Nakajima R, Saitoh T, Kanda T, Vogt K, Sakurai T, Nagaｓe H, Yanagisawa M.
  • Journal Title: PNAS Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Promising techniques to illuminate neuromodulatory control of the cerebral cortex in sleeping and waking states. (2017)
  • Author(s): Kanda T, Ohyama K, Muramoto H, Kitajima N, Sekiya H.
  • Journal Title: Neurosci. Res. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.neures.2017.04.009
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Activation of ventral tegmental area dopamine neurons produces wakefulness through dopamine D2-like receptors in mice. (2017)
  • Author(s): Oishi Y, Suzuki Y, Takahashi K, Yonezawa T, Kanda T, Takata Y, Cherasse Y, Lazarus M.
  • Journal Title: Brain Struct. Funct. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s00429-017-1365-7
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Triethyleneglycol, an active component of Ashwagandha (Withania somnifera) leaves, is responsible for sleep induction. (2017)
  • Author(s): Kaushik MK, Kaul SC, Wadhwa R, Yanagisawa M, Urade Y.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0172508
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Design and Synthesis of Potent and Highly Selective Orexin1 Receptor Antagonists with a Morphinan Skeleton and Their Pharmacologies. (2017)
  • Author(s): Nagase H, Yamamoto N, Yata M, Ohrui S, Okada T, Saitoh T, Kutsumura N, Nagumo Y, Irukayama-Tomobe Y, Ishikawa Y, Ogawa Y, Hirayama S, Kuroda D, Watanabe Y,Gouda H, Yanagisawa M.
  • Journal Title: J Med Chem. Volume: 60 Pages: 1018-1040
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.6b01418
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Peripherally administered orexin improves survival of mice with endotoxin shock. (2016)
  • Author(s): Ogawa Y, Irukayama-Tomobe Y, Murakoshi N, Kiyama M, Ishikawa Y, Hosokawa N, Tominaga H, Uchida S, Kimura S, Kanuka M, Morita M, Hamada M, Takahashi S, Hayashi Y, Yanagisawa M.
  • Journal Title: Elife. Volume: 5 Pages: -
  • DOI: 10.7554/elife.21055
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Forward genetic analysis of sleep in randomly mutagenized mice. (2016)
  • Author(s): Funato H, Miyoshi C, Fujiyama T, Kanda T, Sugiyama F, Takahashi S, Sakimura K, Hayashi Y, Liu Q, Kume K, Wakana S, Takahashi JS, Yanagisawa M.
  • Journal Title: Nature Volume: 539 Pages: 378-383
  • DOI: 10.1038/nature20142 PMID: 27806374
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] QRFP-Deficient Mice Are Hypophagic, Lean, Hypoactive and Exhibit Increased Anxiety-Like Behavior. (2016)
  • Author(s): Okamoto K, Yamasaki M, Takao K, Soya S, Iwasaki M, Sasaki K, Magoori K, Sakakibara I, Miyakawa T, Mieda M, Watanabe M, Sakai J, Yanagisawa M, Sakurai T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0164716
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Timed Inhibition of Orexin System by Suvorexant Improved Sleep and Glucose Metabolism in Type 2 Diabetic db/db Mice. (2016)
  • Author(s): Tsuneki H, Kon K, Ito H, Yamazaki M, Takahara S, Toyooka N, Ishii Y, Sasahara M, Wada T, Yanagisawa M, Sakurai T, Sasaoka T.
  • Journal Title: Endocrinology. Volume: 157 Pages: 4146-4157
  • DOI: 10.1210/en.2016-1404
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of mutations through dominant screening for obesity using C57BL/6 substrains. (2016)
  • Author(s): Hossain MS, Asano F, Fujiyama T, Miyoshi C, Sato M, Ikkyu A, Kanno S, Hotta N, Kakizaki M, Honda T, Kim SJ, Komiya H, Miura I, Suzuki T, Kobayashi K, Kaneda H, Kumar V, Takahashi JS, Wakana S, Funato H, Yanagisawa M.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 6 Pages: -
  • DOI: 10.1038/srep32453
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] High salt induces autocrine actions of ET-1 on innermedullary collecting duct NO production via upregulated ETB receptor expression. (2016)
  • Author(s): Hyndman KA, Dugas C, Arguello AM, Goodchild TT, Buckley KM, Burch M, Yanagisawa M, Pollock JS.
  • Journal Title: Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. Volume: 311 Pages: R263-71
  • DOI: 10.1152/ajpregu.00016.2015
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in Ins1-cre driver mice. (2016)
  • Author(s): Hasegawa Y, Hoshino Y, Ibrahim AE, Kato K, Daitoku Y, Tanimoto Y, Ikeda Y, Takahashi S, Yoshiki A, Yagami K-i, Iseki H, Mizuno S, Sugiyama F.
  • Journal Title: Exp. Anim. Volume: 65 Pages: 319-327
  • DOI: 10.1538/expanim.16-0016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Heterogeneous fibroblasts underlie age-dependent tertiary lymphoid tissues in the kidney. (2016)
  • Author(s): Sato Y, Mii A, Hamazaki Y, Fujita H, Nakata H, Masuda K, Nishiyama S, Shibuya S, Haga H, Ogawa O, Shimizu A, Narumiya S, Kaisho T, Arita M, Yanagisawa M, Miyasaka M, Sharma K, Minato N, Kawamoto H, Yanagita M.
  • Journal Title: JCI Insight. Volume: 1 Pages: -
  • DOI: 10.1172/jci.insight.87680
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Aberrant PD-L1 expression via 3’-UTR disruption in multiple cancers. (2016)
  • Author(s): Kataoka K, Shiraishi Y, Takeda Y, Sakata S, Izutsu K, Takaori-Kondo A, Miyazaki Y, Takahashi S, Shibata T, Kawamoto H, Akatsuka Y, Shimoda K, Takeuchi K, Seya T, Miyano S, Ogawa S., et al.
  • Journal Title: Nature. Volume: 534 Pages: 402-406
  • DOI: 10.1038/nature18294
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hyperlipidemia and hepatitis in liver-specific CREB3L3 knockout mice generated using a one-step CRISPR/Cas9 system. (2016)
  • Author(s): Nakagawa Y, Oikawa F, Ohno H, Yagishita Y, Satoh A, Osaki Y, Takei K, Kikuchi T, Song-iee H, Mizuno S. Matsuzaka T, Iwasaki H, Kobayashi K, Yatoh S, Yahagi N, Suzuki H, Sone H, Takahashi S, Yamada N, Shimano H.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 6 Pages: -
  • DOI: 10.1038/srep27857
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mesolimbic neuropeptide W coordinates stress responses under novel environments. (2016)
  • Author(s): Motoike T, Long JM, Tanaka H, Sinton CM, Skach A, Williams SC, Hammer RE, Sakurai T, Yanagisawa M.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci USA. Volume: 113 Pages: 6023-6028
  • DOI: 10.1073/pnas.1518658113
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Orexin B induces GABAA receptor-mediated tonic inhibition in the locus coeruleus. (2017)
  • Author(s): Yonezawa T, Fukuoka J, Kizuka M, Miyazaki T, Kanda T, Yanagisawa M
  • Organizer: The 94th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
  • Place of Presentation: アクトシティ浜松（静岡県浜松市）
  • Year and Date: 2017-03-29 – 2017-03-30
• [Presentation] Identification of molecular correlates of sleep need by phosphoproteomic analysis (2017)
  • Author(s): Qinghua Liu
  • Organizer: Circadian and sleep medicine symposium
  • Place of Presentation: Dallas, TX, (USA)
  • Year and Date: 2017-03-09 – 2017-03-09
  • Invited
• [Presentation] Neuronal firing in the cerebral cortex during waking and NREM sleep. (2016)
  • Author(s): Ohyama K, Miyazaki T, Kanda T, Makino T, McHugh T, Yanagisawa M, Greene RW, Vogt K
  • Organizer: The 5th Annual IIIS Symposium and the 32nd Wako Workshop
  • Place of Presentation: 東京コンファレンスセンター品川（東京都港区）
  • Year and Date: 2016-12-12 – 2016-12-12
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Orexin B plays an inhibitory role in noradrenergic neurons in the locus coeruleus. (2016)
  • Author(s): Yonezawa T, Fukuoka J, Kizuka M, Miyazaki T, Kanda T, Yanagisawa M
  • Organizer: The 5th Annual IIIS Symposium and the 32nd Wako Workshop
  • Place of Presentation: 東京コンファレンスセンター品川（東京都港区）
  • Year and Date: 2016-12-12 – 2016-12-12
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 延髄背側部に存在する新規睡眠・覚醒制御ニューロン群 (2016)
  • Author(s): 上田壮志、中司大樹、黒川達哉、石川有希子、柿崎美代、シェラス ヨアン、柳沢正史
  • Organizer: 日本睡眠学会第４１回定期学術集会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2016-07-07 – 2016-07-08
• [Patent(Industrial Property Rights)] スルホンアミド誘導体またはその薬学的に許容される酸付加塩 (2016)
  • Inventor(s): 長瀬博、柳沢正史、斉藤毅、沓村憲樹、入鹿山容子
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人筑波大学、ボード・オブ・リージェンツ 他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: PCT/JP2016/067405
  • Filing Date: 2016-06-12
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] モルヒナン誘導体及びその医薬用途 (2016)
  • Inventor(s): 長瀬博、山本直司、入鹿山容子、斉藤毅、柳沢正史、南雲康行
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人筑波大学、東レ株式会社
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2016-155477
  • Filing Date: 2016-08-08
• [Patent(Industrial Property Rights)] 対象動物の睡眠状態を判定するためのコンピュータプログラムおよび睡眠状態判定装置 (2016)
  • Inventor(s): 柳沢正史、佐藤牧人
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人筑波大学、ボード・オブ・リージェンツ 他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: PCT/JP2016/081946
  • Filing Date: 2016-10-27
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] モルヒナン誘導体及びその医薬用途 (2016)
  • Inventor(s): 長瀬博、山本直司、入鹿山容子、斉藤毅、柳沢正史、南雲康行
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人筑波大学、東レ株式会
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: PCT/JP2016/081995
  • Filing Date: 2016-10-28
  • Overseas