2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26220807
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
城 宜嗣 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 主任研究員 (70183051)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤井 仁美 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (50584851)
杉田 有治 国立研究開発法人理化学研究所, 杉田理論分子科学研究室, 主任研究員 (80311190)
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| Project Period (FY) |
2014-05-30 – 2019-03-31
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| Keywords | 酵素反応 / 一酸化窒素 / 環境科学 / 呼吸酵素 / 分子進化 / 脱窒 / 窒素循環 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度構築した緑膿菌をホストとする一酸化窒素還元酵素（cNOR）の発現システムを用いて、in vivoでの変異体活性測定を行った。すなわち、活性のあるcNOR変異体が発現すれば、緑膿菌を生育し、不活性なcNOR変異体が発現すれば緑膿菌は生育しなかった。緑膿菌の生育実験から、各種アミノ酸残基のNO還元活性における重要度を分子構造上にマッピングした。このマップを基に、各種変異体を単離精製し、その機能変異の策定を開始した。
一方、NO産生酵素である亜硝酸還元酵素NiRとcNORとの複合体形成において重要と思われるアミノ酸（Lys119）に変異を入れたcNORを上記発現システムを用いて生育実験を行った。緑膿菌の生育は明らかに遅くなり、この複合体が菌体内にNOを拡散させない重要なシステムであると結論した。NiR-cNORと電子供与体との三者複合体の結晶化にも取り組んでいるが、未だ成功していない。
髄膜炎菌が持つqNOR（キノールを電子供与体とするNOR）の精製に成功し、約４Å分解能のX線回折点を与える結晶を得ることができた。さらに高品質の結晶作製に取り組んでいる。
cNORの酵素反応中に現れる短寿命（μ秒程度）反応中間体の時分割赤外分光スペクトルの測定に成功した。ヘム鉄に結合したNOと非ヘム鉄に結合したNOの伸縮振動を1605および1753cm-1に観測した。現在詳細な電子状態および配位構造を明らかにする目的で、理論計算を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
緑膿菌をホストとした変異体の調製が可能となった事は大きな成果である。現在、いくつかの不活性変異体の分光測定や速度論解析を行い、NO還元反応におけるcNORのいくつかのアミノ酸残基の役割を確定しようとしている。さらに不活性変異体の結晶構造解析が可能となれば、世界で唯一結晶構造情報を持つという、我々のアドバンテージを最大限生かす事ができる。
反応中間体の赤外分光測定が出来た事は今年度の最大に成果である。この反応中間体に関しては、未だどのような方法でも直接観測が出来ていなかった。赤外分光の特徴を最大限生かした成果である。
未だ４Åではあるが、髄膜炎菌qNORの結晶が得られた事は評価できる。病原菌の生存に必須の酵素である事、未だ世界で活性なqNORの構造情報はない事などから、今後の進展が期待できる。
NiR-cNORと電子供与体との三者複合体の結晶化が未だ成功していない。超分子複合体になるので、クライオ電顕での構造決定を考え、専門家に試料作製に関して共同研究を開始した。
分子動力学と量子化学計算が本格的に稼働し、NiR-cNOR複合体のシミュレーションと反応中間体の配位構造・電子状態の理論的解明をめざす事が出来るようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
２年目にすべてのテーマが順調に進み始めているので、このペースをさらに加速し、本年度から論文として発表していきたい。特にNiR-cNOR複合体構造解析の成果に関しては、生体内のNO動態という観点から、学会等では注目されている。分子動力学計算の成果が出るのを待って、高いレベルの学術誌に投稿する予定である。
緑膿菌をホストとするcNOR発現系を用いて、①プロトン輸送、②電子輸送、③NO配位に関わるアミノ酸残基を変異させた変異体を種々作製し、すべてに関して分光測定、活性測定、反応速度解析、結晶構造解析を行う。これにより、NO還元反応の分子機構解明とそれを基にした呼吸酵素の分子進化の議論を深めて行きたい。
cNORの短寿命反応中間体の時分割測定は、スペクトルの経時変化や重水中の測定と、理論計算の成果を合わせてな、配位構造と電子状態の詳細な解明をめざす。さらにプロトン伝達経路を遮断した変異体を用いて、現在観測している中間体に続いて現れる第二の中間体（ハイポナイトライト中間体）の同定をめざす。これにより、NOR酵素反応の分子機構のさらなる詳細な解明を期待している。髄膜炎菌qNORに関しても同様の測定を行う予定である。
さらに、脱窒菌NORのさきがけとして、SACLAを利用して、取扱がより簡便な脱窒カビNORの短寿命反応中間体の結晶構造解析を開始する。
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[Journal Article] A Nearly On-axis Spectroscopic System for Simultaneously Measuring UV-visible Absorption and X-ray Diffraction in the SPring-8 Structural Genomics Beamline2016
Author(s)
M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, Y. Yamaguchi, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
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Journal Title
J. Synchro. Rad.
Volume: 23
Pages: 334-338
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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