独自の培養系を用いた腸管上皮幹細胞における生体恒常性維持機構の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26221307
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 渡邉 守 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (10175127)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土屋 輝一郎 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 准教授 (40376786) ; 中村 哲也 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (70265809)
• Project Period (FY): 2014-05-30 – 2019-03-31
• Keywords: 腸内環境 / 共培養 / 幹細胞機能評価 / 疑似モデル構築 / 全身制御

Outline of Annual Research Achievements

炎症性腸疾患では腸管上皮細胞の機能不全による腸内環境破綻が難治性の原因と示唆される。申請者は腸管上皮幹細胞運命を人為的に制御し、腸内環境を改善させることが生体恒常性までもリセットすることにより炎症性腸疾患を根本的に解決できると着想した。申請者らが独自に確立した「腸管上皮幹細胞初代培養」と「幹細胞移植モデル」をさらに発展させ、擬似腸管環境モデル構築による腸管上皮幹細胞の運命制御及び腸管免疫・内分泌制御を含めた腸内環境・生体恒常性への関与を解明する。最終的には腸管上皮幹細胞による腸内環境、生体恒常性リセットという新たな機序を創成し臨床応用への基盤を構築するだけでなく、腸疾患に留まらず生活習慣病などの全身疾患を制御できるという新しい概念を提唱するものである。
本年度は高効率移植モデルの構築を行った。これまで、マウスに硫酸デキストラン（DSS）を自由飲水し大腸に自然発生する潰瘍に移植を行っていたが、潰瘍が小さく移植細胞による置換率は低いため、経肛門的にEDTAを注入し人工的により効率の良い移植モデルを構築した。
さらに小腸初代培養細胞を大腸に移植することにも成功しており、大腸粘膜であっても小腸の構造、分化が幹細胞運命に則り制御された結果、小腸絨毛を維持することを明らかとした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

順調に以下の研究成果が得られた。
１）初代培養オルガノイドによる擬似腸内環境モデルの構築
腸管上皮細胞と腸管上皮内リンパ球との共培養系を構築した。共焦点顕微鏡にて３次元で腺菅とリンパ球の接合が継時的に観察可能だけでなく、リンパ球運動の定量化に成功した。さらにリンパ球の性状解析を行ったところ、組織内リンパ球と同様の分画を培養系においても維持していることを確認した。また炎症環境を擬似化するための慢性炎症モデルを構築した。１年間以上の長期刺激により、非可逆的な細胞形質転換を確認し、細胞の低栄養耐性獲得など一部がん化の形質を有することを発見した。
２）腸管上皮幹細胞機能評価法の確立
本年度は独自に腸管オルガノイドへの遺伝子導入法を確立し、１幹細胞をmCherry蛍光蛋白発現にて可視化することに成功した。さらに幹細胞マーカープロモーターを用いた幹細胞可視化も試み、ヒト大腸由来オルガノイドの幹細胞可視化に一部成功している。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は、以下のプロジェクトを進める予定である。
腸管上皮細胞とリンパ球、腸内細菌など共培養系の構築をさらに進め、腸内環境疑似モデルの構築に努める。幹細胞制御機能に関しては、ヒト検体収集を引き続き行い、炎症性腸疾患患者だけでなく、生活習慣病患者の腸管オルガノイド培養を行う基盤を整備する。

Research Products

• [Journal Article] Reduced human α-defensin 6 in non-inflamed jejunal tissue of Crohn’s disease patients. (2016)
  • Author(s): Hayashi R, Tsuchiya K, Fukushima K, Horita N, Hibiy S, Kitagaki K, Negi M, Itho E, Akashi T, Eishi Y, Okada E, Araki A, Ohtsuka K, Fukuda S, Ohno H, Okamoto R, Nakamura T, Tanaka S, Chyayama K, Watanabe M
  • Journal Title: Inflamm Bowel Dis. Volume: 22 Pages: 1119-1128
  • DOI: 10.1097/MIB.0000000000000707.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. (2016)
  • Author(s): Nozaki K, Mochizuki W, Matsumoto Y, Matsumoto T, Fukuda M, Mizutani T, Watanabe M, Nakamura T
  • Journal Title: J Gastroenterol. Volume: 51 Pages: 206-213
  • DOI: 10.1007/s00535-016-1170-8.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Safety and Efficacy of AJM300, an Oral Antagonist of α4 Integrin, in Induction Therapy for Patients with Active Ulcerative Colitis. (2015)
  • Author(s): Yoshimura N, Watanabe M, Motoya S, Tominaga K, Matsuoka K, Iwakiri R, Watanabe K, Hibi T
  • Journal Title: Gastroenterology Volume: 49 Pages: 1775-1783
  • DOI: 10.1053/j.gastro.2015.08.044
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Atonal homolog 1 protein stabilized by tumor necrosis factor α induces high malignant potential in colon cancer cell line. (2015)
  • Author(s): Fukushima K, Tsuchiya K, Kano Y, Horita N, Hibiya S, Hayashi R, Kitagaki K, Negi M, Itoh E, Akashi T, Eishi Y, Oshima S, Nagaishi T, Ryuichi O, Nakamura T, Watanabe M
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 106 Pages: 1000-1007
  • DOI: 10.1111/cas.12703
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Correlation of the Endoscopic and Magnetic Resonance Scoring Systems in the Deep Small Intestine in Crohn's Disease. (2015)
  • Author(s): Takenaka K, Ohtsuka K, Kitazume Y, Nagahori M, Fujii T, Saito E, Fujioka T, Matsuoka K, Naganuma M, Watanabe M
  • Journal Title: Inflamm Bowel Dis. Volume: 21 Pages: 1832-1838
  • DOI: 10.1097/MIB.0000000000000449
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] TNFAIP3 promotes survival of CD4 T cells by restricting MTOR and promoting autophagy. (2015)
  • Author(s): Matsuzawa Y, Oshima S, Takahara M, Maeyashiki C, Nemoto Y, Kobayashi M, Nibe Y, Nozaki K, Nagaishi T, Okamoto R, Tsuchiya K, Nakamura T, Averil Ma, Watanabe M
  • Journal Title: Autophagy Volume: 11 Pages: 1052-1062
  • DOI: 10.1080/15548627.2015.1055439
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] RIPK3 regulates p62-LC3 complex formation via the caspase-8-dependent cleavage of p62. (2015)
  • Author(s): Matsuzawa Y, Oshima S, Nibe Y, Kobayashi M, Maeyashiki C, Nemoto Y, Nagaishi T, Okamoto R, Tsuchiya K, Nakamura T, Watanabe M
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 456 Pages: 298-304
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.11.075
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Establishment of a 3D cell culture-based screening platform to identify natural products that can regulate transepithelial water transport of the human gastrointestinal tract. (2015)
  • Author(s): Fujii Satoru, Okamoto Ryuichi, Nakata Toru, Suzuki Kohei, Ishibashi Fumiaki, Kawamoto Ami, Segawa Sayaka-Ohashi, Mizutani Tomohiro, Tsuchiya Kiichiro, Nakamura Tetsuya, Mamoru Watanabe
  • Organizer: Pacifichem2015
  • Place of Presentation: Hawaii（U.S.A.）
  • Year and Date: 2015-12-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Contiuous stimulation with cytokines leads to irreversible activation of NF-kB signaling in colonic epithelial cells by organoid culture. (2015)
  • Author(s): Shuji Hibiya, Kiichiro Tsuchiya, Tomoaki Shirasaki, Keita Fukushima, Ryohei Hayashi, Nobukatsu Horita, Shigeru Oshima, Ryuichi Okamoto, Tetsuya Nakamura, M. Watanabe
  • Organizer: UEGW2015.
  • Place of Presentation: Barcelona（Spain）
  • Year and Date: 2015-10-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A novel fluorescent labelling system into small intestinal organoid reveals independent long-lived intestinal stem cells in a crypt. (2015)
  • Author(s): Nobuyuki Horita, Kiichiro Tsuchiya, Ryohei Hayashi, Keita Fukushima, Shuji Hibiya, Masayoshi Fukuda, Tomohiro Mizutani, Ryuichi Okamoto, Testuya Nakamura and M. Watanabe
  • Organizer: AOCC2015
  • Place of Presentation: 北京（China）
  • Year and Date: 2015-06-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Stem Cell Transplantation in Inflammatory Bowel Disease (IBD). (2015)
  • Author(s): Mamoru Watanabe
  • Organizer: GIGIS2015
  • Place of Presentation: 広州（China）
  • Year and Date: 2015-06-05
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Enrichment of Intestinal Stem Cells by the 3D-Culture of IBD Patient Derived Intestinal epithelium. (2015)
  • Author(s): Kohei Suzuki, Satoru Fujii, Toru Nakata, Ami Kawamoto, Fumiaki Ishibashi, Sayaka Ohashi Segawa, Tomohiro Mizutani, Kiichiro Tsuchiya, Kazuo Otsuka,Tetsuya Nakamura, Ryuichi Okamoto, M. Watanabe
  • Organizer: DDW 2015
  • Place of Presentation: Washington,D.C.（U.S.A.）
  • Year and Date: 2015-05-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Continuous Stimulation With Cytokines Leads to Irreversible Accumulation of NF-kB Signaling in Colonic Epithelial Cells. (2015)
  • Author(s): Shuji Hibiya, Kiichiro Tsuchiya, Keita Fukushima, Ryohei Hayashi, Nobukatsu Horita, Shigeru Oshima, Ryuichi Okamoto, Tetsuya Nakamura, M. Watanabe
  • Organizer: DDW 2015
  • Place of Presentation: Washington,D.C.（U.S.A.）
  • Year and Date: 2015-05-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Adult Tissue Stem Cell Therapy in Inflammatory Bowel Disease. (2015)
  • Author(s): Mamoru Watanabe
  • Organizer: 第2回日中医学交流フォーラム・消化器シンポジウム
  • Place of Presentation: ザ・プリンスさくらタワー東京（東京都港区）
  • Year and Date: 2015-05-13
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Intestinal Stem Cell Transplantation for IBD Therapy. (2015)
  • Author(s): Mamoru Watanabe
  • Organizer: 第101回日本消化器病学会総会ワークショップ
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2015-04-25
  • Invited