2015 Fiscal Year Annual Research Report
Runx2遺伝子の転写制御機構の解明と、骨粗鬆症・変形性関節症治療薬の開発
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26221310
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川根 徹也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (00265208)
宮崎 敏博 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
森石 武史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983)
増山 律子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (60297596)
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| Project Period (FY) |
2014-05-30 – 2019-03-31
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| Keywords | Runx2 / 骨芽細胞 / エンハンサー / 軟骨細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Runx2は骨形成において中心的な役割を果たす一方、関節軟骨等に対しては破壊的な作用を持ち、変形性関節症の原因分子となる。Runx2遺伝子の発現制御領域を特定するために、BACクローンを用いて、エクソン１上流130 kb、イントロン１，エクソン２を含む約200 kbのゲノムDNAの下流にGFPをつないだコンストラクトを構築、生理的な発現パターンを再現できるトランスジェニックマウスの作製に成功した。この200 kbの領域を６つに分け、それぞれを欠失する6種類のtgマウスを作製し、その１つの領域から、1.3 kbの骨芽細胞特異的エンハンサーを特定した。さらに、軟骨細胞特異的エンハンサーを含む7.2 kbを同定した。この２つの領域以外にエンハンサー領域がないか調べるために、Runx2遺伝子の上流、イントロン、下流領域で種を超えた相同性が認められる領域を探索した。このうち２領域に関し、その領域を欠失させたノックアウトマウスを新たに作製した。
Runx2 ObEnfl/+ (ObEn: osteoblast-specific enhancer, fl: flox)マウスで、germline transmissionを得た。さらに、サザンブロット解析により、1.3kbの欠失を確認した。その後、frpマウスと交配し、neoを除いた。1.3kbエンハンサーのコアエレメントである340bpのノックアウトマウスもgermline transmissionを得た。
骨形成作用のある化合物を同定するため、骨芽細胞特異的エンハンサーを４つタンデムに並べたルシフェラーゼベクター（pGL4.23-4x343）を用い、本学所有の化合物（１万）および他大学（２万）からあつめた化合物を用い、スクリーニングを行った。これにより、新たに活性の高い３化合物を得た。また、新たに合成した１化合物で高い活性を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで、解析してきた２領域以外にも、エンハンサー活性を持つ領域がないか、網羅的に調べることにした。種を超えた塩基配列の相同性、および骨芽細胞・軟骨細胞分化に関わる転写因子結合配列の有無を指標にCas9/CRISPRシステムを使って、順次ノックアウトマウスを作製し、生理的な重要性を指標に検索を進めている。Cas9/CRISPRシステムでエンハンサー候補領域の欠失を起こさせる頻度も高く得られるようになり、２７年度は２領域のノックアウトマウスを作製した。
骨芽細胞特異的エンハンサー1.3 kbのfloxマウスおよびそのコアエレメントである340bpのノックアウトマウスの作製は順調に進んだ。
化合物ライブラリーのスクリーニングは順調に進んでおり、ルシフェラーゼ活性だけでなく、Runx2 mRNAも上げる化合物も得られている。逆に、その両者を抑制する化合物も得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Runx2の上流、イントロン、下流で、種を超えた塩基配列の相同性、および骨芽細胞・軟骨細胞分化に関わる転写因子結合配列の有無を指標にCas9/CRISPRシステムを使って、今後も順次候補領域の欠失マウスを作製していく。同時に、野生型マウス由来軟骨細胞のマイクロマス培養、初期培養骨芽細胞、ATDC細胞を用いてH3K4me1, H3K27Ac抗体を用いたChIP sequenceを行い、Runx2遺伝子領域でエンハンサーに特徴的なクロマチン修飾部位を同定する。両者を併用することにより、エンハンサーの同定と生理的意義の解析を同時に進めていく。
骨芽細胞特異的エンハンサー1.3 kbのfloxマウスは、CAG Cre(germline Cre)マウス、1.3 kbエンハンサーCreマウス、Col1a1 Creマウス、Col2a1 Creマウス、Dermo 1 Creマウスと交配していく。
他大学から集めた新たな化合物ライブラリーのスクリーニングをさらに進める。さらに、新たに合成した化合物のスクリーニングも進める。これまで得られた活性の高い化合物の周辺化合物を調べ、より活性の高い化合物を得る。有望な化合物は、マイクロアレイ解析で、その作用機序を調べる。
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[Journal Article] Cbfb regulates bone development by stabilizing Runx family proteins.2015
Author(s)
Qin X, Jiang Q, Matsuo Y, Kawane T, Komori H, Moriishi T, Taniuchi I, Ito K, Kawai Y, Rokutanda S, Izumi S, Komori T.
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Journal Title
Journal of bone and mineral research
Volume: 30
Pages: 706-714
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Cbfb plays important roles in bone development through the stabilization of Run family proteins.2015
Author(s)
Qin X,Jiang Q,Matsuo Y,Kawane T,Komori H,Moriishi T,Taniuchi I, Ito K,Kawai Y,Rokutanda S,Izumi S, Komori T.
Organizer
The RUNXTranscription Factors in Development and Disease
Place of Presentation
Weizmann Institude of Science,Rehovot,Israel
Year and Date
2015-10-18 – 2015-10-21
Int'l Joint Research
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