2014 Fiscal Year Annual Research Report
医薬工連携による画期的診断システムの構築と心不全に対する新規診断法の開発
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26242055
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
堤 康央 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (50263306)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 豪 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263204)
角田 慎一 独立行政法人医薬基盤研究所, その他部局等, その他 (90357533)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 検査・診断システム / 抗体 / 心不全 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、国民病ともいえる心不全を例に、プロテオミクスなど活用して診断用バイオマーカーを同定したうえで、高親和性の抗体を創製することで、心不全に対する有用な体外診断法を開発することを目的とする。
上記の目的を達成するために本年度は、心臓冠血管の出口である冠状静脈洞血（CS血）と、冠血管の入口の血液として大腿動脈血（FA血）を対象に、各血液からCS血で発現上昇している蛋白質を網羅的に探索した。一般に、血清中に多量に存在するアルブミンなどの蛋白質（mg/ml）が、目的の蛋白質（ng-pg/ml）同定の妨げになることが知られている。そこでまず、効率よく微量蛋白質を同定するために、抗体カラムを用いて血清中の多量蛋白質を除去し、その除去効率について評価した。SDS-PAGE解析の結果、未処理のサンプルでは、アルブミンなどの多量蛋白質のバンドが多く観察された一方、処理後のサンプルでは、これらバンドは消失し、未処理サンプルでは観察できなかった多数のバンドが確認された。そこで次に、iTRAQ解析により、発現変動蛋白質の同定を試みた。その結果、合計668種類の蛋白質が同定され、特に、CS血清で2倍以上発現上昇している蛋白質が4種類見出された。これら蛋白質は、抗菌蛋白質や酵素蛋白質として報告されているものの、興味深いことに、心臓からの分泌や心機能に関する報告はなく、新たな心分泌関連バイオマーカーとなり得ることが期待される。
一方で、診断用バイオマーカーが同定された際に、円滑に高感度検出系を構築できるように、抗体の親和性向上技術のマチュレーションを図った。既に、X線結晶構造解析に成功している抗原-抗体の3次元立体構造情報をもとに、変異導入し、熱力学的パラメーターの変化を解析した。その結果、Hot Spotの遠隔の位置での変異導入が抗体の安定性・親和性向上にとって有効であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書の研究実施計画で記載した通り、プロテオーム解析によって、候補となる発現変動蛋白質を見出すことができているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度に見出した4種類の候補蛋白質について、western blotting法やELISA法といった別法により、発現量の違いを検証する。また、上記の結果は、1症例に対するプレリミナリーな結果であるため、症例検体数を増やすことで心不全バイオマーカー候補蛋白質としての確度を高める予定である。さらに、様々な血清中多量蛋白質除去法も考慮・評価することで、心分泌関連バイオマーカーの候補を増やす予定である。
また、高感度検出系の構築に向け、X線結晶構造解析するための蛋白質の結晶化技術の開発など、抗体の親和性向上に関わる基盤技術の進展を図る。
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[Journal Article] Identification and evaluation of metastasis-related proteins, oxysterol binding protein like 5 and calumenin, in lung tumor.2015
Author(s)
Kazuya Nagano, Suano Imai, Xiluli Zhao, Takuya Yamashita, Yasuo Yoshioka, Yasuhiro Abe, Yohei Mukai, Haruhiko Kamada, Shinsaku Nakagawa, Yasuo Tsutsumi, Shin-ichi Tsunoda.
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Journal Title
International Journal of Oncology
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] The search for heart secretory proteins as heart disease biomarkers.2014
Author(s)
Toshinobu Ogura, Yohei Mukai, Makiko Maeda, Yasushi Fujio, Yasushi Sakata, Kazuma Higashisaka, Yasuo Yoshioka, Kazuya Nagano, Haruhiko Kamada, Shin-ichi Tsunoda, Yasuo Tsutsumi.
Organizer
HUPO 13th Annual World Congress
Place of Presentation
Madrid (Spain)
Year and Date
2014-10-05 – 2014-10-08
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