2014 Fiscal Year Annual Research Report
電場・温度場制御による細胞・組織の接触式不可逆エレクトロポレーション
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26249021
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
高松 洋 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20179550)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藏田 耕作 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00368870)
福永 鷹信 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 技術専門職員 (60591196)
WANG Haidong 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (30729405)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 不可逆エレクトロポレーション / 低侵襲治療 / 温度計測 / デバイス開発 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は，不可逆エレクトロポレーションの更なる低侵襲化を目的として，ジュール発熱による温度上昇の計測方法の確立，細胞膜の破壊目的の定量化，低電圧印加MEMSエレクトロポレータの開発を行った．
①電圧印加時のジュール発熱による組織の温度上昇を計測するため，感温性インクを添加した生体ファントム試料を対象として白金細線を使用した短細線法によって感温性インクの温度特性を調べた．白金短細線法の解析解をインクの輝度値の変化と比較することで，インクの輝度値から温度上昇量を求めることが可能になった．実際に生体ファントムに対してエレクトロポレーションを行い，電極周囲のインクの輝度値の変化から温度上昇量を計測した．
②パルス電圧を印加した後の細胞膜の穿孔状態や膜電位計測，生死判定などを等電位面に直交した面から観察できるようなマイクロギャップエレクトロポレータの設計製作を行った．これはITO膜を蒸着した2枚のガラス基板の間に厚さ50ミクロンのシリコンゴムシートを挟んだものである．この流路に膜電位感受性色素DiBAC4(3)で染色した細胞懸濁液を滴下し，電圧印加した時の細胞膜電位の変化を蛍光観察する方法を確立した．
③低電圧印加MEMSエレクトロポレータの開発のため，静電場の数値シミュレーションを行い，細胞膜を破壊するために最適な電極の形状を決定した．これを基に微小櫛形電極の製作にとりかかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は，①エレクトロポレーションに起因した温度上昇の計測とその予測，②細胞破壊プロセスの観察，③低電圧印加MEMSエレクトロポレータの開発を行う予定であった．
①については，生体ファントム内に配置した白金細線の加熱量から細線周辺の温度上昇を解析し，感温性インクの輝度値の変化と比較することで，試料内温度と輝度値の関係を定式化した．この輝度-温度検定式を用いて，生体試料にエレクトロポレーションを行った際に最高温度上昇量がタンパク質の変性危険温度に達しているかどうかを計測する方法を確立した．
②については，ITO膜を蒸着したガラス基板を用いてマイクロギャップエレクトロポレータを試作できた．新たに導入した高感度蛍光顕微イメージングシステムを用いて，膜電位感受性色素DiBAC4(3)で染色した細胞を観察した．しかし，色素の反応速度に問題があり，細胞膜破壊の過程を鮮明に観察するには至っていない．
③については，数値シミュレーションより電極幅は200μm，電極間距離50μmとした櫛形電極が最適な形状であると決定した．この電極によって30Vで最大壊死深さ60μmを得ることができる．この電極をフォトリソグラフィ法によりガラス基板上に白金薄膜のパターンを形成することで作製した．また電極作製の手順や露光時間などの条件を最適化し，電極作製法を確立した．
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画2年目となる平成27年度は以下に示す内容の研究を進める．
①タンパク質の熱変性の定量化手法を確立し，様々な条件でタンパク質の熱変性を計測する． 感温性のインクを混入したアガロースおよびアルブミンからなる生体ファントムを試料として，様々な印加条件（パルス幅，間隔，印加回数）でパルスを印加し，電極周辺部の温度上昇を検出する．方法としては，光学顕微鏡によって電極周囲の感温性インクの輝度値を計測するほか，レーザーラマン顕微鏡によってラマンイメージングを行い，Amide I領域のスペクトルに注目し，アルブミンの熱変性によって生じるα-helix構造からβ-sheet構造への変化を定量化する．
②細胞膜穿孔に及ぼす電圧印加条件の影響を明らかにし，細胞破壊条件を決定する． パルス印加条件のうち電圧印加による電位勾配とパルス印加回数を変えながら細胞懸濁液にエレクトロポレーションを行い，細胞致死率を求めることによって細胞死に関わるパルス印加条件の影響を調べる．キュベット電極に線維芽細胞の懸濁液を加え，異なるパルス印加条件によるエレクトロポレーションを行う．蛍光観察による細胞致死率の評価を行い，細胞致死率に対するパルス印加条件の影響を明らかにする．
③MEMSエレクトロポレータによる実験を行い，その有効性を明らかにする． 初年度の電場解析により得られた電極幅，電極間距離を参考にして作製した微小表面エレクトロポレータを用い，生体ファントムを試料に実験を行う．生体ファントムは線維芽細胞を分散させたアガロースゲルとし，MEMSエレクトロポレータに接触させてパルス印加を行い，試料染色をすることで印加電圧と細胞壊死の関係を調査しその有効性を検証する．
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