2016 Fiscal Year Annual Research Report
電場・温度場制御による細胞・組織の接触式不可逆エレクトロポレーション
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26249021
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
高松 洋 九州大学, 工学研究院, 教授 (20179550)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藏田 耕作 九州大学, 工学研究院, 准教授 (00368870)
Wang Haidong 九州大学, 工学研究院, 助教 (30729405)
福永 鷹信 九州大学, 工学研究院, 技術職員 (60591196)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 不可逆エレクトロポレーション / 低侵襲治療 / 温度測定 / デバイス開発 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成28年度は以下に示す内容の研究を進めた．
①細胞膜穿孔プロセスの観察と薬剤添加による低電圧化の検討
2枚のガラス製透明電極と流路から形成されるマイクロギャップエレクトロポレータを作製して，共焦点レーザー顕微鏡ステージ上で電気パルスを与えながら蛍光観察のできるシステムを構築した．このシステムを用いて，細胞に電気パルスを印加したときの細胞膜電位の変化を膜電位感受性色素DiBAC4(3)やDiSBAC2(3)を用いて観察することを試みた．極短時間で生じる膜穿孔現象と膜電位の変化を蛍光色素の発光強度変化として計測する難しさのため，細胞膜が損傷していく過程や再シールされる過程を観察するには至っていない．しかし，電圧印加前後の膜電位の違いを計測することには成功した．電気パルスの低電圧下を図るために，DMSO，SDSなどの界面活性剤の添加が膜破壊閾値に与える影響について調べた．キュベット内の細胞分散液に電圧印加する実験系とアガロースゲルに細胞を包埋した生体ファントムに電圧印加する実験系の両方で研究を実施した．その結果，DMSOの添加によって濃度依存的に膜破壊閾値を低減できることが明らかになった．その効果は10％DMSO添加時に閾値電界を10％低下させられる程度であった．
②MEMSエレクトロポレーションの改良と最適化
前年度に引き続き，ガラス基板上に作製した微細櫛形電極を用いた．電極を生体ファントムに押し付けて電気パルスを印加する実験において，電圧印加条件が壊死深さに与える影響を調べた．電圧を100V，パルス長さを100μsまで大きくしても，細胞壊死領域は表層より0.1mm程度に留まることが明らかになった．さらに，電極の厚さが非常に薄い（約50nm）ために，電圧を大きくした場合，電圧印加の途中に電極が溶断する可能性のあることが明らかになった．電極の耐久性を高める方策が必要と思われた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度は，①細胞膜穿孔プロセスの観察と薬剤添加による低電圧化の検討，②MEMSエレクトロポレーションの改良と最適化，の2つの研究を進める予定であった．
①では，当初の計画通りマイクロギャップエレクトロポレータを作製し，流路内の細胞に電気パルスを与えながら共焦点レーザー顕微鏡で観察できるシステムを構築した．まず，CC2-DMPEとDiSBAC2(3)によって予め細胞を染色し膜電位の計測を試みた．陽極側の細胞膜が破壊し，細胞質が外部へ流出する様子を観察することはできたが，膜破壊直前に生じるはずの膜電位の変化を計測するには時間分解能が不十分であった．膜電位感受性色素DiBAC4(3)を用いた実験では，電気パルス印加後に細胞内の蛍光強度が上昇する過程を計測できた．この上昇には膜電位の変化だけでなく，膜穿孔による蛍光色素の細胞内拡散が関与している．電気パルスの低電圧下を図るために，界面活性剤のDMSOとSDSが膜破壊閾値に与える影響について調べた．いずれも膜破壊閾値を下げることが確かめられたが，SDSについては電気パルスなしでも有意な細胞致死が観察され，無視できないほどの毒性の高さが明らかになった．一方，DMSOの添加は濃度依存的に膜破壊閾値を低減させ，その効果は10％DMSO添加時に閾値電界を10％低下させられる程度であった．
②では，作製した微細櫛形電極を用いて，電圧とパルス長さが細胞壊死深さに与える影響を調べた．電圧を100V，パルス長さを100μsまで大きくしても，表層より0.1 mm程度の細胞しか壊死させることは出来なかった．また，電極が非常に薄く，ガラス基板との接着性も低いために，電圧印加の途中に溶断や剥離と思われる電極の損傷を生じた．電極の耐久性を高めるために，金属張りポリイミドフィルムをエッチングして電極を作製する方法が有効であると考え，試作を行っている．
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画最終年度となる平成29年度は以下に示す内容の研究を進める．
①実際の医療用デバイスのための微細電極エレクトロポレータを試作，実験する．
前年度の研究では，ガラス基板上にフォトリソグラフィー法によって微細櫛形電極を作製しエレクトロポレーション実験を行った．しかし，電極の厚さが非常に薄い（約50 nm）ために，電圧印加の途中に電極が溶断する場合のあることが明らかになった．そこで今年度は，ポリイミド上の金属箔をエッチングすることによって厚さ数ミクロンの微細櫛形電極を作製する手法を試みる．電極の溶断を防いで耐久性を向上させることによって，実験試料に十分な電界を形成できるようになると思われる．また，電極が柔軟なポリイミド基板で支持されるために，平坦ではない試料に対してもフィットさせて電圧印加を行うことが出来るようになる．
②微細電極エレクトロポレータを用いた実験で薬剤添加の効果を検証する．
線維芽細胞をアガロースゲル中に分散培養した生体ファントムを実験試料に用いて，電圧印加条件や薬剤添加の効果を①で作製した微細電極エレクトロポレータによって検証する．
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