2016 Fiscal Year Annual Research Report
Genome editing technology with efficient transfer to nucleus using nanoneedle
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26249127
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
中村 史 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究グループ長 (40357661)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 義雄 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (20415657)
池袋 一典 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70251494)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / ナノニードル / アプタマー / オフターゲット効果 / 細胞操作 / 制御放出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、人工ヌクレアーゼを用いて目的遺伝子以外の部分に損傷を与えない安全で確実、高効率なゲノム編集技術を開発することを目的としている。平成28年度は、SELEXにより取得されたFokIアプタマー及びCas9アプタマーの性能を評価し、細胞への輸送効率を検討した。まず、FokIアプタマーとして取得されたF6#8、F6#71の2種のアプタマーを、ナノニードルに修飾してZFN-GFPの細胞への導入を試み、導入が可能であることを確認した。但し、細胞外分泌物による脱離促進効果が確認され、迅速な挿入動作が必要であることが明らかとなった。Cas9に対して細胞内の高濃度のカリウムイオンに応答して結合が解離するアプタマーを探索し、150 mM NaClから150 mM KClへ変更することにより、30%脱離する7K16及び60%脱離する7K27の2種が取得された。CDスペクトル解析の結果、7K16はパラレル型とアンチパラレル型のグアニン四重鎖構造（G4）の混合物、もしくはハイブリッド型のG4を形成し、カリウムイオン存在下では、アンチパラレル型に移行することが示唆され、カリウムイオンの有無でCas9の脱離が制御できることを支持する結果を得た。Cas9アプタマーを修飾したナノニードルを作製し、Cas9もしくはCas9-sgRNA複合体を固定化し、150 mM KCl条件での放出量を評価したところ、いずれのアプタマーでもCas9-sgRNAでも固定化量、放出量が著しく低下し、sgRNA結合サイトとアプタマー結合サイトが競合している可能性が示唆された。またCas9アプタマーを介してCas9-GFPをナノニードル表面へ結合し細胞への導入を検討した結果、細胞内での放出は確認されたものの細胞膜へのCas9-GFPの吸着が観察され、Cas9の正電荷の集中する領域が細胞膜と静電的相互作用すると推察された。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(29 results)
