H3K9メチル化による転写抑制の実体の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26250039
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 眞貝 洋一 独立行政法人理化学研究所, 眞貝細胞記憶研究室, 主任研究員 (20211972)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 内在性レトロウイルス / 転写抑制 / CRISPR-Cas9 / スクリーニング / ノックアウト / ノックダウン

Outline of Annual Research Achievements

本課題では、H3K9 メチル化による転写抑制の分子機構の実体の明らかにするため、１）H3K9メチル化酵素G9aの標的遺伝子の転写抑制機構を明らかにする、２）H3K9メチル化酵素GESET/Setdb1 により抑制されるレトロ転移因子の転写抑制機構を明らかにする、３）G9a とSetdb1 の解析から得られた知見を元に“H3K9 メチル化による転写抑制シグナルカスケード”の統合的理解を目指す、の研究を計画した。その中で、Ｈ２６年度は、以下の研究を行った。
I）shRNAによるノックダウンあるいはCas9によるノックアウトスクリーニング系の確立
shRNAノックダウンスクリーニングにはCelecta社が提供しているマウスshRNAライブラリーを入手した。一方、Cas9によるノックアウトスクリーニングでは、英国サンガー研究所の遊佐宏介博士の作成したCas9/gRNAライブラリー系を用いるため、必要な細胞及びgRNA発現レンチウイルスベクターを遊佐博士より入手した。
II）Setdb1 下流遺伝子スクリーニング系の構築とスクリーニングの開始
遊佐博士が確立したCas9を恒常的に発現するES細胞に、GFP レポーター遺伝子を持つレトロウイルス（MSCV-GFP）を感染させ、２週間培養した後、GFP陰性の細胞をセルソーターで分取し、サブクローニングした細胞でSetdb1 gRNAを導入した際にGFPが発現してくるクローンを選択した。これをレポーター細胞として、mouse shRNA あるいはgRNAのLenti virus ライブラリーを感染させ、感染５日目にGFP陽性画分をセルソーターで分取し、この細胞からshRNAあるいはgRNAのゲノムDNAを回収、次世代シークエンサーによりシークエンス解析を行った。現在、このスクリーニングで同定された上位ヒットの遺伝子に関して、評価・検証を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

２つ計画しているスクリーニングのうち１つは実験を開始し、既に複数の新規遺伝子を同定するに至っている。その観点から本研究課題はおおむね順調に進展していると判断している。

Strategy for Future Research Activity

予定通り、同定された新規遺伝子の機能解析を進めると同時に、さらに現在のスクリーニングを進める。また、もう１つのスクリーニングも系を確立し、こちらもＨ２７年度中にヒット遺伝子の同定を行いたい。今のところ、本研究を推進する上での問題点はない。