海底下生命のセンサス：地球内部における生命活動の地理的空間分布と規定要因の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26251041
• Research Institution: Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
• Principal Investigator: 稲垣 史生 独立行政法人海洋研究開発機構, 高知コア研究所, グループリーダー (50360748)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 星野 辰彦 独立行政法人海洋研究開発機構, 高知コア研究所, 主任研究員 (30386619)
• Project Period (FY): 2014-06-27 – 2017-03-31
• Keywords: 海洋掘削科学 / 海底堆積物 / 海底下生命圏 / デジタルPCR / 遺伝子定量 / 次世代シーケンサー / IODP

Outline of Annual Research Achievements

地球規模の海底下生命のバイオマス・多様性・代謝機能に関するセンサスを実施するため、過去10年に渡って採取され凍結された海底下堆積物試料からのDNA抽出を行った。
具体的には、まず、30を超える掘削地点から得られた深度の異なる試料（海底下0メートル～400メートル）、合計300程度の凍結コア試料の内部を無菌的にサブサンプリングした。DNAの抽出方法により得られる微生物群衆構造にバイアスがかかることが知られているため、本研究では一般的に用いられている市販の環境ゲノム抽出キット（米国MoBIO社製 Power Max Soil DNA Kit）および研究代表者の研究グループで開発された熱・アルカリ環境ゲノム抽出法の2種類の手法を用いて環境ゲノムを抽出した。アルカリ抽出法では、これまでは効率的にDNAが抽出できないことが知られているアーキアからも効率的にDNAが抽出可能であるが、その反面、フミン酸などアルカリ溶解物質が共抽出されやすいため、抽出DNAの精製が必須である。本研究においては、抽出DNA精製方法についても検討を行い、フィージビリティーと再現性の観点からシリカメンブレンカラムによる精製を採用することとした。精製された全600本の環境DNAは小分けにし、-80℃で保管した。平成27年度以降に行うdigital PCRによる遺伝子定量に備えて、海底下DNA試料に適したPCR酵素の選定および反応条件の最適化を行った。さらに、次世代シーケンサー（イルミナ社製Miseq）の導入を行い、機器の立ち上げやシーケンシングの一連のプロトコルの確立を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定していた300試料からの２つの異なる方法によるDNA抽出を終えることができた。また、平成27年度以降に行う予定である遺伝子定量およびシーケンシングの基礎的検討を終え実験プロトコルを確立した。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度に調製した環境ゲノム（約600試料）を用いて、16S rRNA遺伝子をターゲットにしたdigital PCRを行いバクテリア・アーキアの構成比および存在量を定量する。16S rRNAに加えて、元素・物質循環に重要な役割を果たす代表的な鍵酵素機能遺伝子も合わせて定量する。
さらに平成26年度に導入、立ち上げを行った次世代シーケンサーにより上記DNAサンプルから16S rRNAをPCRにより増幅し、その塩基配列を解読、微生物群衆構造を解明する。それぞれのサンプルにおける微生物学的多様性、またサンプル間の類似度、地質学・堆積学・鉱物学的因子との関係を海洋研究開発機構のスーパーコンピューターを用いて解析する。

Research Products

• [Journal Article] Presence of oxygen and aerobic communities from sea floor to basement in deep-sea sediments (2015)
  • Author(s): D’Hondt, S., Inagaki, F., Zarikian, C.A., Abrams, L.J., Dubois, N., Engelhardt, T., Evans, H., Ferdelman, T., Gribsholt, B., Harris, R.N., Hoppie, B.W., Hyun, J.-H., Kallmeyer, J., Kim. J., Lynch, J.E., McKinley, C.C., Mitsunobu, S., Morono, Y., Murray, R.W., Pockalny, R., et al.
  • Journal Title: Nature Geoscience Volume: 8 Pages: 299-304
  • DOI: 10.1038/ngeo2387
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Low frequency of endospore-specific genes in subseafloor sedimentary metagenomes (2015)
  • Author(s): Mikihiko Kawai, Ikuo Uchiyama, Hideto Takami, Fumio Inagaki
  • Journal Title: Environmental Microbiology Reports Volume: 7 Pages: 341-350
  • DOI: 10.1111/1758-2229.12254
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Intact preservation of environmental samples by freezing under an alternating magnetic field (2015)
  • Author(s): Yuki Morono, Takeshi Terada, Yuhji Yamamoto, Nan Xiao, Takehiro Hirose, Masaya Sugeno, Norio Ohwada, Fumio Inagaki
  • Journal Title: Environmental Microbiology Reports Volume: 7 Pages: 243-251
  • DOI: 10.1111/1758-2229.12238
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Origins of lithium in submarine mud volcano fluid in the Nankai accretionary wedge (2015)
  • Author(s): Yoshiro Nishio, Akira Ijiri, Tomohiro Toki, Yuki Morono, Masaharu Tanimizu, Kazuya Nagaishi, Fumio Inagaki
  • Journal Title: Earth and Planetary Science Letters Volume: 414 Pages: 144-155
  • DOI: 10.1016/j.epsl.2015.01.018
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cross-Species, Amplifiable Microsatellite Markers for Neoverrucid Barnacles from Deep-Sea Hydrothermal Vents Developed Using Next-Generation Sequencing (2014)
  • Author(s): Yuichi Nakajima, Chuya Shinzato, Mariia Khalturina, Hiromi Watanabe, Fumio Inagaki, Nori Satoh, Satoshi Mitarai
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 15 Pages: 14364-14371
  • DOI: 10.3390/ijms150814364
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An improved sample preparation method for imaging microstructures of fine-grained marine sediment using microfocus X-ray computed tomography and scanning electron microscopy (2014)
  • Author(s): Go-Ichiro Uramoto, Yuki Morono, Katsuyuki Uematsu, Fumio Inagaki
  • Journal Title: Limnology and Oceanography-Methods Volume: 12 Pages: 469-483
  • DOI: 10.4319/lom.2014.12.469
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A new hybrid pressure-coring system for the drilling vessel Chikyu (2014)
  • Author(s): Y Kubo, Y Mizuguchi, F Inagaki, K Yamamoto
  • Journal Title: Scientific Drilling Volume: 17 Pages: 37-43
  • DOI: 10.5194/sd-17-37-2014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Gold-ISH: A nano-size gold particle-based phylogenetic identification compatible with NanoSIMS (2014)
  • Author(s): Kengo Kubota, Yuki Morono, Motoo Ito, Takeshi Terada, Shogo Itezono, Hideki Harada, Fumio Inagaki
  • Journal Title: Systematic and Applied Microbiology Volume: 4 Pages: 261-266
  • DOI: 10.1016/j.syapm.2014.02.003
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Exploring deep life in coal-bearing sediments down to ~2.5km below the seafloor (2015)
  • Author(s): Fumio Inagaki, Kai-Uwe Hinrichs and IODP Expedition 337 shipboard and shore-based scientists
  • Organizer: Deep Carbon Observatory (DCO) 2nd International Science Meeting
  • Place of Presentation: ミュンヘン、ドイツ
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
  • Invited
• [Presentation] 地球深部探査船「ちきゅう」による海底下生命圏の探求 ー海底下の森に生命を探るー (2015)
  • Author(s): 稲垣史生
  • Organizer: 四国紙パルプ研究協議会設立40執念記念講演会
  • Place of Presentation: 高知大学農学部、高知県南国市
  • Year and Date: 2015-03-10
  • Invited
• [Presentation] IODP Expedition 337 Deep coalbed biosphere off Shimokita (2014)
  • Author(s): Fumio Inagaki, Kai-Uwe Hinrichs
  • Organizer: ECORD Summer School 2014
  • Place of Presentation: ブレーメン、ドイツ
  • Year and Date: 2014-10-22 – 2014-10-26
  • Invited
• [Presentation] Methodological advances for the identification of subseafloor communities and their activities (2014)
  • Author(s): Fumio Inagaki, Yuki Morono, Motoo Ito, Tatsuhiko Hoshino
  • Organizer: ECORD Summer School 2014
  • Place of Presentation: ブレーメン、ドイツ
  • Year and Date: 2014-10-22 – 2014-10-26
  • Invited
• [Presentation] 海底下生命圏の地球横断的解析ー存在量・多様性を規定する因子の解明ー (2014)
  • Author(s): 星野辰彦，諸野祐樹，寺田武志，稲垣史生
  • Organizer: 環境微生物系学会合同大会2014
  • Place of Presentation: 浜松アクトシティー、静岡県浜松市
  • Year and Date: 2014-10-17 – 2014-10-20
• [Presentation] 科学海洋掘削による地球深部生命の探究 (2014)
  • Author(s): 稲垣史生
  • Organizer: 高知大学コア保管庫落成記念シンポジウム
  • Place of Presentation: 高知大学海洋コア総合研究センター、高知県南国市
  • Year and Date: 2014-10-17
  • Invited
• [Presentation] Global Subseafloor Microbiomes Project (2014)
  • Author(s): Tatsuhiko Hoshino, Yuki Morono, and Fumio Inagaki
  • Organizer: International Symposium for Subsurface Microbiology (ISSM) 2014
  • Place of Presentation: ソウル、韓国
  • Year and Date: 2014-10-05 – 2014-10-10
• [Presentation] The deep mud-volcano biosphere in the Nankai Trough accretionary complex (2014)
  • Author(s): Fumio Inagaki, Akira Ijiri, Yuki Morono, Tatsuhiko Hoshino, and Expeditions 903 and 906 Scientists
  • Organizer: International Symposium for Subsurface Microbiology (ISSM) 2014
  • Place of Presentation: モントレー、米国
  • Year and Date: 2014-10-05 – 2014-10-10
• [Presentation] Drilling technology and contamination assessment for deep and low-biomass samples (2014)
  • Author(s): Fumio Inagaki, Kai-Uwe Hinrichs, Yusuke Kubo
  • Organizer: Deep Carbon Observatory (DCO) Deep Life Directory Meeting
  • Place of Presentation: モントレー、米国
  • Year and Date: 2014-10-02 – 2014-10-05
  • Invited
• [Presentation] Limits and habitability of subseafloor life in the deep sedimentary biosphere (2014)
  • Author(s): Fumio Inagaki, Kai-Uwe Hinrichs, Steven D'Hondt
  • Organizer: International Society for Microbial Ecology (ISME) 2014
  • Place of Presentation: ソウル、韓国
  • Year and Date: 2014-09-24 – 2014-09-29
  • Invited
• [Presentation] Limits and habitability of subseafloor life in the deep sedimentary biosphere (2014)
  • Author(s): Fumio Inagaki, Kai-Uwe Hinrichs, Steven D'Hondt
  • Organizer: 中国海洋大学
  • Place of Presentation: 青島、中国
  • Year and Date: 2014-07-23
  • Invited
• [Presentation] Limits and habitability of subseafloor life in the deep sedimentary biosphere (2014)
  • Author(s): Fumio Inagaki, Kai-Uwe Hinrichs, Steven D'Hondt
  • Organizer: 上海交通大学
  • Place of Presentation: 上海、中国
  • Year and Date: 2014-07-20
  • Invited
• [Presentation] 日本近海の海底炭化水素資源と炭素循環 (2014)
  • Author(s): 稲垣史生
  • Organizer: 高知市市民大学
  • Place of Presentation: 高知カルポートプラザ、高知県高知市
  • Year and Date: 2014-07-15
  • Invited
• [Book] Developments in Marine Geology volume 7, Earth and Life Processes Discovered from Subseafloor Environments, (eds.) R. Stein, D. Blackman, F. Inagaki, and H.C. Larsen (2014)
  • Author(s): Fumio Inagaki and Victoria Orphan
  • Total Pages: 829 (39-63)
  • Publisher: Elsevier