2016 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanism mediating estrogen feedback to regulate follicular development and ovulation in domestic animals
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26252046
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
束村 博子 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00212051)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163)
平林 真澄 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 准教授 (20353435)
前多 敬一郎 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (30181580)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | キスペプチン / GPR54 / GnRH / メタスチン / エストロゲン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ほ乳類のメスの卵胞発育と排卵を制御するエストロゲン（E2）の負および正のフィードバックによる性腺刺激ホルモン分泌制御の分子メカニズムの解明とその応用の検証を目的としている。本年度はE2のフィードバック作用を仲介すると考えられるキスペプチンニューロンにおける、E2のキスペプチン遺伝子（Kiss1）発現に対する効果を明らかにすることを目的とし、次のin vitroおよびin vivo実験を実施した。In vitro実験：キスペプチンニューロン由来の不死化細胞株の作製およびスクリーニングを実施した。雌ラットより採取した前腹側室周囲核（AVPV）あるいは弓状核（ARC）をから得た細胞をSV40 T-antigenにより不死化し、AVPVあるいはARCよりそれぞれ85個、91個の候補細胞株を得た後、リアルタイムPCRにより、Kiss1、neurokinin B（NKB）遺伝子、dynorphine A （Dyn）遺伝子、E2受容体遺伝子（Esr1）などのキスペプチンニューロンに特徴的に発現する遺伝子群の発現を指標とし絞り込みを行った。その結果、有力なARC 候補株として rR49、rR60 株を、AVPV 候補株として rV7、rV73、rV79 を得た。さらに、ARC候補株rR49に、キスペプチン、NKB、Dynが発現することを免疫組織化学により確かめた。その後、本株のE2 添加による Kiss1 発現量の変化を解析した所、E2による有意な変化は得られなかった。In vivo実験：性成熟前ラットを用いて、E2依存性にKiss1発現が抑制されることを明らにした。一方で、NKBおよびDyn遺伝子については、性成熟前後で大きな違いは認められなかった。このことから、性成熟前にはKiss1特異的にE2が発現抑制効果を有することを明らかにした
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitro実験：エストロゲンによるキスペプチン遺伝子発現制御（正および負のフィードバック）の分子機構を明らかにするためのツールとして、当初の目的のとおり、有力な不死化細胞培養株を得た。一方で、最有力株を用いてエストロゲン添加実験をした結果、予想と異なり、残念ながら、ARCあるいはAVPV由来不死化株で、キスペプチン遺伝子発現が、抑制（ARC）あるいは促進（AVPV）されなかったため、現在進行形で、新たな他の候補株により同様の実験を実施している。
In vivo実験：性成熟前のラットを用いて、E2依存性にキスペプチン遺伝子発現が抑制されることを明らにした。一方で、NKBおよびDyn遺伝子については、性成熟前後でそれら遺伝子発現に大きな違いは認められなかった。このことから、性成熟前にはキスペプチン遺伝子特異的にE2が発現抑制効果を有することを明らかにした。また、昨年度までに得た、Kiss1発現制御に関わる可能性が高い転写因子群のsiRNA投与実験の為の、脳手術の実験計画もたてつつあり、総合として、概ね順調に進展していると自己評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で有力株のE2 添加による Kiss1 発現量の変化を解析したところ、残念ながらE2による有意な変化を得ることができなかったため、これまで得られた別の候補株のリアルタイムPCR結果を精査し、同様の手法を用いて、新たな有力候補株を検索中である。すでに候補株を複数有しているので、次年度中には、有力な株を得、次段階に進めると考えている。
また、可視化キスペプチンニューロンのトランスクリプトーム解析結果を精査し、ARCあるいはAVPV特異的にKiss1発現制御に関わる可能性が高い転写因子群を既にリスト化したので、これら転写因子の発現抑制をin vivoで確認するための準備を進めている。
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[Journal Article] CRISPR/Cas9-mediated genome editing in wild-derived mice: generation of tamed wild-derived strains by mutation of the a (nonagouti) gene.2017
Author(s)
Hirose, M., Hasegawa, A., Mochida, K., Matoba, S., Hatanaka, Y., Inoue, K., Goto, T., Kaneda, H., Yamada, I., Furuse, T., Abe, K., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Wakana, S,. Honda, A. and Ogura, A.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 7
Pages: 42476
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Immunohistochemical characterization of the arcuate kisspeptin/neurokinin B/dynorphin (KNDy) and preoptic kisspeptin neuronal populations in the hypothalamus during the estrous cycle in heifers.2016
Author(s)
Hassaneen ASA, Naniwa Y, Suetomi Y, Matsuyama S, Kimura K, Ieda N, Inoue N, Uenoyama Y, Tsukamura H, Maeda K-I, Matsuda F, Ohkura S.
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Journal Title
J. Reprod. Dev.
Volume: 62(5)
Pages: 471-477
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Neonatal kisspeptin is steroid-independently required for defeminisation and peripubertal kisspeptin-induced testosterone is required for masculinisation of the brain: A behavioural study using Kiss1 KO rats.2016
Author(s)
Nakamura, S., Uenoyama, Y., Ikegami, K., Dai, M., Watanabe, Y., Takahashi, C., Hirabayashi, M., Tsukamura, H. and Maeda, K.-I.
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Journal Title
J. Neuroendocrinol.
Volume: 999
Pages: 999
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Molecular and epigenetic mechanism regulating hypothalamic Kiss1 gene expression in mammals.2016
Author(s)
Uenoyama, Y., Tomikawa, J., Inoue, N., Goto, T., Minabe, S., Ieda, N., Nakamura, S., Watanabe, Y., Ikegami, K., Matsuda, F., Ohkura, S., Maeda, K.I. Tsukamura, H.
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Journal Title
Neuroendocrinology
Volume: 103
Pages: 640-649
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Maturation and physiology of hypothalamic regulation of the gonadal axis.2016
Author(s)
Uenoyama, Y., Inoue, N., Ieda, N., Pheng, V., Maeda, K.-I. and Tsukamura, H.
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Journal Title
Springer
Volume: 999
Pages: 1-11
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Cell-to-cell communication via gap junctions may play a role in gonadotropin-releasing hormone pulse generation.2016
Author(s)
Ikegami, K., Ieda, N., Minabe, S., Goto, T., Inoue, N., Maeda, K.-I., Tsukamura H., and Yoshihisa Uenoyama
Organizer
International Symposium on Pituitary Gland and Related Systems (ISPGRS 2016)
Place of Presentation
East-West Center, University of Hawaii
Year and Date
2016-09-01 – 2016-09-05
Int'l Joint Research
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[Presentation] Establishment of rat kisspeptin neuronal cell lines.2016
Author(s)
Kei Horihata, Nahoko Ieda, Noko Inoue, Yoshihisa Uenoyama, Yuta Suetomi, Fuko Matsuda, Kei-ichiro Maeda, Hiroko Tsukamura
Organizer
International Symposium on Pituitary Gland and Related Systems (ISPGRS 2016)
Place of Presentation
East-West Center, University of Hawaii
Year and Date
2016-09-01 – 2016-09-05
Int'l Joint Research
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