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2014 Fiscal Year Annual Research Report

ダイズ根粒菌の共生進化ダイナミズムと温室効果ガス削減の分子機構

Research Project

Project/Area Number 26252065
Research InstitutionTohoku University

Principal Investigator

南澤 究  東北大学, 生命科学研究科, 教授 (70167667)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 佐藤 修正  東北大学, 生命科学研究科, 准教授 (70370921)
内田 隆史  東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (80312239)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords生物間相互作用 / 共生 / タンパク質分泌系 / 脱窒
Outline of Annual Research Achievements

ダイズ根粒菌のRj2-ダイズ共生不和合性の分子機構:分泌タンパク質のプロテオーム解析に基づき、エフェクター候補遺伝子Bj122_1969が見いだされたが、単独でRj2不和合性を誘導するエフェクターではなかった。そこで、不和合性株/和合性株グループのゲノム比較およびRj2ダイズ共生表現型に基づいて見いだされた約17個のエフェクター候補遺伝子について酵母two hybrid解析用のベクターにクローニングし、ダイズのRj2原因遺伝子(Glyma16g33780)との相互作用解析系を確立した。
ダイズ根粒菌nasSTによる脱窒遺伝子発現制御の遺伝学的解析:異化的硝酸還元の最初の過程である硝酸還元(nap)と最後のN2O還元(nos)を担う遺伝子発現のみNasTにより正に制御されていた。NasTは硝酸無添加の好気条件でもnapとnos遺伝子の発現誘導と活性上昇をもたらし、酸素センサーFixLJの下流のfixK2遺伝子の発現が顕著に発現上昇した。しかし、硝酸存在下の嫌気的条件では、NasTによるfixK2遺伝子の上昇は全く認められなかった。したがって、これらの条件ではNasTによる異なった制御システムの存在が示唆された。一般にNasTによる硝酸同化系遺伝子の発現制御は、Antitermination機構によるが、nap/nos/fixK2遺伝子上流にはNasTが結合できるヘアピン構造は見いだされなかった。そこで、NasTタンパク質とRNA断片の相互作用を検出できるゲルシフトアッセイの実験系を確立した。
ダイズ根粒菌の脱窒制御蛋白質NasS、NasTの構造機能解析:大腸菌で野生型、変異型のNasSと NasTタンパク質を作成し、これらが分子複合体を形成すること、また、硝酸/亜硝酸添加によりこの複合体が2分子に分離することを明らかにした。次に、野生型、変異型のCFP-nasT、nasS-Venus(YFP)を作成した。これらの複合体は二分子FRETとして検出可能であり、またuMオーダーのNO3-/NO2-の濃度変化をFRETの変化からとらえることができた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、 (1) 植物共生細菌がどのように病原システムを取り入れて共進化してきたのか、(2)温室効果ガス除去に重要な根粒菌N2O還元酵素遺伝子の転写促進を促す二成分制御系NasSTの制御機構を明らかすることを目的とした。
ダイズ根粒菌のRj2-ダイズ共生不和合性の分子機構については、不和合性株/和合性株グループのゲノム比較およびRj2ダイズ共生表現型のデータ解析を進め候補遺伝子が挙げられ、酵母two hybrid法によるダイズのRj2原因遺伝子との相互作用の解析をできる実験系を確立した。本年度に計画している不和合性株全ゲノム塩基配列決定で、Rj2原因エフェクターの実態に確実に近づくと考えられる。
ダイズ根粒菌nasSTの解析では、NasTがどのようにnapとnos遺伝子を制御しているかを明らかにすることが最終目標である。脱窒系遺伝子は一般に低酸素分圧と硝酸などの窒素酸化物により強い誘導がかかる。昨年度は、硝酸無添加の好気条件と硝酸存在下の嫌気的条件ではFixK2を経由したNasTによる複雑な制御システムの存在が示唆された。NasTタンパク質とRNAのゲルシフトアッセイ系が確立したことは、今後NasTがどのようにnapとnos遺伝子を制御しているか、分子レベルでの相互作用を見る上で大きな前進である。さらに、大腸菌で野生型、変異型のNasSと NasTタンパク質を作成し、これらが分子複合体を形成すること、また、硝酸/亜硝酸添加によりこの複合体が2分子に分離することを明らかにした。次に、野生型、変異型のCFP-nasT、nasS-Venus(YFP)を作成した。これらの複合体は二分子FRETとして検出可能であり、またuMオーダーのNO3-/NO2-の濃度変化をFRETの変化からとらえることができた。このセンサーをsNOOOpy systemと命名した。これらの成果とその背景の論文を公表した。

Strategy for Future Research Activity

ダイズ根粒菌のRj2-ダイズ共生不和合性の分子機構:本年度の結果を踏まえて、Rj2不和合性を誘導する根粒菌エフェクターの同定のために、昨年度確立した酵母two hybrid法によるダイズのRj2原因遺伝子との相互作用の解析を行う。さらに、USDA122株の完全長ゲノムを決めて解析の精度を上げ、複数のエフェクターが関与する場合にも対応できる戦略も加える。さらに、不和合性と和合性のダイズ根粒菌の分泌タンパク質の相違をプロテオーム解析で明らかにし、Rj2不和合性誘導の原因エフェクターの同定を目指したい。
ダイズ根粒菌nasSTによる発現制御については、RNA seqの結果を待って、NasTの制御ネットワークと制御モチーフを明らかにする。また、NasTとRNA結合部位を実験的に同定できるゲルシフトアッセイ系が確立したので、nap/nos/fixK2遺伝子等の上流のRNA断片とのゲルシフトアッセイを実施する。また、嫌気条件で5%-20%のN2Oガスを投与するとnap遺伝子の発現が有意に上昇した。これはN2Oセンサーやシグナル伝達系の存在を示唆しているので、余裕がある場合はN2Oの有無によるRNA seq解析を行う。
sNOOOpy (sensor for physiological NO3-/NO2-) system (NO3-/NO2-の濃度変化をFRETの変化からとらえるセンサー)を動物細胞で応用することを検討する。また、NasSとNasTおよびNasS/NasT複合体の結晶化、NO3-/NO2-添加時のNasTの結合状態の結晶化解析を行う

  • Research Products

    (19 results)

All 2015 2014

All Journal Article (9 results) (of which Peer Reviewed: 9 results,  Acknowledgement Compliant: 8 results,  Open Access: 5 results) Presentation (8 results) (of which Invited: 3 results) Book (2 results)

  • [Journal Article] Preference of endophytic bradyrhizobia in different rice cultivars and the implication of rice endophyte evolution2015

    • Author(s)
      Piromyou, P., T. Greetatorn, K. Teamtisong, T. Okubo, R. Shinoda, A. Nuntakij, P. Tittabutr, N. Boonkerd, K. Minamisawa, and N. Teaumroong
    • Journal Title

      Appl. Environ. Microbiol.

      Volume: in press Pages: in press

    • DOI

      10.1128/AEM.04253-14

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Elevated atmospheric CO2 levels affect community structure of rice root-associated bacteria2015

    • Author(s)
      Okubo, T., D. Liu, H. Tsurumaru, S. keda, S. Asakawa, T. Tokida, K. Tago, M. Hayatsu, N. Aoki, K. Ishimaru, K. Ujiie, Y. Usui, H. Nakamura, H. Sakai, K. Hayashi, T. Hasegawa, and K. Minamisawa
    • Journal Title

      Front. Microbiol.

      Volume: 6:136 Pages: -

    • DOI

      10.3389/fmicb.2015.00136

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Metagenomic analysis of bacterial community associated with main root of sugar beet.2015

    • Author(s)
      Tsurumaru, H., T. Okubo, K. Okazaki, M. Hashimoto, K. Chiba-Kakizaki, E. Hanzawa, H. Takahashi, N. Asanome, F. Tanaka, Y. Sekiyama, S. Ikeda, and K. Minamisawa.
    • Journal Title

      Microbes Environ.

      Volume: 30(1) Pages: 63-69

    • DOI

      10.1264/jsme2.ME14109

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Characterization of leaf blade-and leaf sheath-associated bacterial community and assessment of their responses to environmental changes of CO2, temperature, and nitrogen levels under field conditions2015

    • Author(s)
      Ikeda, S., T. Tokida, H. Nakamura, H. Sakai, Y. Usui, T. Okubo, K. Tago, K. Hayashi, Y. Sekiyama, M. Hayatsu, T. Hasegawa, and K. Minamisawa
    • Journal Title

      Microbes Environ.

      Volume: 30(1) Pages: 51-62

    • DOI

      10.1264/jsme2.ME14117

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Correlation between soil type and N2O reductase genotype (nosZ) of indigenous soybean bradyrhizobia: nosZ-minus populations are dominant in Andosols2014

    • Author(s)
      Shiina, Y., M. Itakura, H. Choi, Y. Saeki, M. Hayatsu, and K. Minamisawa
    • Journal Title

      Microbes Environ.

      Volume: 29(4) Pages: 420-426

    • DOI

      10.1264/jsme2.ME14130

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Phylogeny and functions of bacterial communities associated with field-grown rice shoots2014

    • Author(s)
      Okubo, T., S. Ikeda, K. Sasaki, K. Ohshima, M. Hattori, T. Sato, and K. Minamisawa
    • Journal Title

      Microbes Environ.

      Volume: 29(3) Pages: 329-332

    • DOI

      10.1264/jsme2.ME14077

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] The nitrate-sensing NasST system regulates nitrous oxide reductase and periplasmic nitrate reductase in Bradyrhizobium japonicum2014

    • Author(s)
      Sanchez, C., M. Itakura, T. Okubo, T. Matsumoto, H. Yoshikawa, A. Gotoh, M. Hidaka, T. Uchida, and K. Minamisawa
    • Journal Title

      Environ Microbiol.

      Volume: 16(10) Pages: 3263-3274

    • DOI

      10.1111/1462-2920.12546

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Metaproteomic identification of diazotrophic methanotrophs and their localization in root tissues of field-grown rice plants2014

    • Author(s)
      Bao, Z., T. Okubo, K. Kubota, Y. Kasahara, H. Tsurumaru, M. Anda, S. Ikeda, and K. Minamisawa
    • Journal Title

      Appl Environ Microbiol.

      Volume: 80(16) Pages: 5043-5052

    • DOI

      10.1128/AEM.00969-14

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] NODULE INCEPTION creates a long-distance negative feedback loop involved in homeostatic regulation of nodule organ production.2014

    • Author(s)
      Soyano T, Hirakawa H, Sato S, Hayashi M, Kawaguchi M.
    • Journal Title

      Proc Natl Acad Sci U S A.

      Volume: 111 Pages: 14607-14612

    • DOI

      10.1073/pnas.1412716111

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ワークショップ「入れ子型構造か彩る新生命観」根粒菌共生アイラントのマトリョーシカ型進化2015

    • Author(s)
      南澤究
    • Organizer
      第89回細菌学会総会
    • Place of Presentation
      長良川国際会議場(岐阜市)
    • Year and Date
      2015-03-23 – 2015-03-25
    • Invited
  • [Presentation] 日本ダイズコアコレクションにおける共生不和合性Rj2遺伝型の分布2015

    • Author(s)
      菅原雅之、南澤究
    • Organizer
      第8回ダイズ研究会
    • Place of Presentation
      岩手大学農学部(岩手県盛岡市)
    • Year and Date
      2015-03-06 – 2015-03-07
  • [Presentation] Establishment of the Lotus japonicus genomic information toward functional genomics.2014

    • Author(s)
      Shusei Sato
    • Organizer
      3rd Asian Conference on Plant-Microbe Symbiosis and Nitrogen Fixation
    • Place of Presentation
      The New International Convention & Exposition Center (Chengdu, China)
    • Year and Date
      2014-10-28 – 2014-10-30
    • Invited
  • [Presentation] 共生不和合性を誘導するダイズ根粒菌のタイプIII型エフェクターの探索2014

    • Author(s)
      岩野裕也、鈴木悠太、柿崎芳里、菅原雅之、佐藤修正、南澤究
    • Organizer
      環境微生物系学会合同大会2014
    • Place of Presentation
      浜松アクトシティ コングレスセンター(静岡県浜松市)
    • Year and Date
      2014-10-21 – 2014-10-24
  • [Presentation] 微生物ゲノム情報を圃場で活かす ― 作物根圏からの温室効果ガス発生を制御するために ―2014

    • Author(s)
      南澤究
    • Organizer
      平成26年度日本農学会シンポジウム
    • Place of Presentation
      東京大学弥生講堂(東京都文京区)
    • Year and Date
      2014-10-04
    • Invited
  • [Presentation] 共生窒素固定を促進するダイズ根粒菌III型分泌系エフェクター2014

    • Author(s)
      鈴木悠太、Cristina Sanchez、柿崎芳里、菅原雅之、佐藤修正、金子貴一、南澤究
    • Organizer
      第24回植物微生物研究交流会
    • Place of Presentation
      佐賀大学農学部(佐賀市)
    • Year and Date
      2014-09-19 – 2014-09-21
  • [Presentation] 共生窒素固定を促進するダイズ根粒菌III型分泌系エフェクター2014

    • Author(s)
      鈴木悠太、Cristina Sanchez、柿崎芳里、佐藤修正、金子貴一、南澤究
    • Organizer
      日本土壌肥料学会2014年度東京大会
    • Place of Presentation
      東京農工大学小金井キャンパス(東京都小金井市)
    • Year and Date
      2014-09-09 – 2014-09-11
  • [Presentation] The nitrate-sensing NasST system regulates nitrous oxide reductase in Bradyrhizobium japonicum2014

    • Author(s)
      Cristina Sanchez, Manabu Itakura, Takashi Okubo, Takashi Matsumoto, Hirofumi Yoshikawa, Aina Gotoh, Masafumi Hidaka, Takafumi Uchida, Kiwamu Minamisawa
    • Organizer
      15th International Symposium on Microbial Ecology
    • Place of Presentation
      Coex Comvention Center (Seoul, Korea)
    • Year and Date
      2014-08-24 – 2014-08-29
  • [Book] シリーズ21世紀の農学 ここまで進んだ!飛躍する農学2015

    • Author(s)
      南澤究
    • Total Pages
      171 (85-102)
    • Publisher
      株式会社 養賢堂 編集者:日本農学会
  • [Book] The Lotus japonicus genome (Chapter 4. Genome sequencing)2014

    • Author(s)
      Shusei Sato and Stig Andersen
    • Total Pages
      267 (35-40)
    • Publisher
      Springer

URL: 

Published: 2016-06-01  

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