2014 Fiscal Year Annual Research Report
匂い成分を認識触媒する多様なNADH系酵素を用いた高感度な生化学式蛍光ガスセンサ
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26280053
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
三林 浩二 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 教授 (40307236)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒川 貴博 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 講師 (50409637)
當麻 浩司 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 助教 (40732269)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 生化学式蛍光ガスセンサ / NADH / 還元酵素 / 脱水素酵素 / 光計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、多様な匂い成分の認識素子として利用が可能な各種の脱水素酵素や還元酵素での補酵素であるNADH（又はNADPH）について、その蛍光(em. 339nm近傍、flu. 491近傍)の蛍光計測系を構築し、高感度フォトマルチプライアや自家蛍光を抑制した高分子を独自に合成し酵素の固定化に用いることで、高感度な匂い成分モニタリングが可能な新規な人工嗅覚を開発することである。
初年度は既製品である340nmのピーク波長を有する高輝度UV-LEDを購入し、既存の光源ユニットに組み込むことで励起光源を作製し、NADH蛍光計測系を構築した。本センサに各種の脱水素酵素を用い、一般的なアルコール類（エタノール）などの匂い成分を対象とする蛍光式匂いセンサを試作した。次に、NADHを基質とする還元反応を触媒する酵素として、キラル（不斉）合成酵素であるエノン還元酵素(enone reductase)を用いて、加齢に伴う生体臭であるtrans-2-ノネナールを蛍光測定するセンサを構築した。エノン還元酵素はケトンやアルデヒドと共役した炭素-炭素二重結合を還元することから、この酵素を用いることでノネナールを、NADHを補酵素として還元触媒することで、ノネナールガスの選択的な検知を可能とした。またNADHを基質とする還元反応を触媒する酵素として、脱水素酵素（ADH）の逆反応を利用したセンサの試作を進めており、溶液中のアルデヒドの測定を可能としており、気相でのアルデヒドガス計測に展開中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請課題の目的は、これまでに取り組んできた「生化学式ガスセンサ（匂いセンサ）」の技術をもとに、ＮＡＤＨ高感度計測系をなどの蛍光計測用光学機器を、脱水素酵素群と組み合わせ、高感度の光学式匂いセンサを開発するもので、特にNADHを基質とする還元酵素系を用いることで多様に匂い成分を対象としたセンサを構築し、連続モニタリングが可能な高感度な匂いセンサを開発し、新規な人工嗅覚を構築することである。そして26年度の研究では、特に還元酵素や脱水素酵素を用いた、生体臭や有機溶媒用の蛍光式高感度匂いセンサを試作し、その性能を調べることであった。
これに対して、申請者らは加齢臭成分であるtrans-2-ノネナールについて、ケトンやアルデヒドと共役した炭素-炭素二重結合を還元するキラル（不斉）合成酵素であるエノン還元酵素(enone reductase)を利用することでNADHを補酵素として還元触媒し、その触媒反応でのNADHの消費を高感度なNADH計測系で捉えることで、新たにノネナールガスの検知を可能とした。また脱水素酵素を用いた反応系では、正反応でのNADHの増加を観察し、アルデヒド溶液の逆反応でのNADH減少の検出による測定の可能性を見出したが、蛍光特性の最適化には至っておらず、アルデヒドガスの定量までには至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの結果を踏まえ27年度では、還元型ＮＡＤＨの高感度蛍光計測について蛍光特性の最適化を念頭に、高輝度UV-LEDと高感度フォトマルチプライアを導入し、自家蛍光を抑制した酵素固定化ポリマーの合成を行い、生化学式蛍光ガスセンサ素子の開発と特性評価を行う。近年、材料技術の発展に伴い、265-340nm の紫外領域の安定で高輝度なUV-LEDの製品開発を進んでおり、最適波長の高輝度UV-LEDを導入する。また酵素担持膜としては、蛍光特性が少ない親水性ＰＴＦＥ膜(H-PTFE膜)を選択し、包括固定化用の高分子材料(MPC-co-EMHA)は独自に合成・改良する。センサシステムでは、MPC-co-EMHAにて固定化した脱水素酵素膜を先端感応部に装着して用いる。しかし、そのままでは感応部に匂い成分やその代謝産物が蓄積して、光学出力値の初期値へのシグナル復帰機能が得られない。そこで嗅覚の粘膜層に相当する自作の洗浄システムを光ファイバ先端に取り付け、酵素反応に不可欠なＮＡＤ+溶液の循環システムを組み込む。これによりＮＡＤ+を常時供給しながら、匂い成分の連続的な計測を可能とする。対象とする匂い成分では、脱水素酵素を用いた反応系として、アルデヒドガスの逆反応でのNADH減少の検出による測定の可能性を見出す。
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| Causes of Carryover |
26年度ではNADHの光学特性を分光器にて評価を行い、既製品である340nmのピーク波長を有する高輝度UV-LEDを購入し、既存の光源ユニットに組み込むことで励起光源を作製し、NADH蛍光計測系を構築することで研究費の支出を抑制しながら、NADHの減少の検出および蛍光計測を実現することができた。27年度（次年度）では蛍光特性を調べると共に、高輝度UV-LEDと高感度フォトマルチプライアを導入し、自家蛍光を抑制した酵素固定化ポリマーの合成を行い、光学素子や各種の酵素群、化学試薬、機械・電気部品などを購入し、生化学式蛍光ガスセンサ素子の開発と特性評価を行うことから、当初の計画以上の費用支出が発生する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度には還元型ＮＡＤＨの高感度蛍光計測については蛍光特性評価を進めながら、当初予定通り高輝度UV-LEDと蛍光波長特性に優れた高感度フォトマルチプライアを設備導入し、自家蛍光を抑制した酵素固定化ポリマーの合成を行い、生化学式蛍光ガスセンサ素子の開発と特性評価を行う。実験用設備としては現有設備に加え、NADH励起用高輝度UV-LEDと高感度フォトマルチプライアを設備導入し、光スペクトラム・アナライザと高感度分光器、ファンクションジェネレータ、高度ドラフトチャンバ、緩衝液冷却系、二重式暗ブースを用いて、既製品の光学素子や各種の酵素群、化学試薬、機械・電気部品などの物品費に支出し研究を進める。またこれまでの実験結果の国内外学会会議での発表や、学術論文への投稿費用にも充当する。また研究を加速するため、実験補助等への謝金にも支出する。
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Research Products
(2 results)
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[Presentation] Highly sensitive fiber-optic formaldehyde gas sensor (biosniffer) for food-sample detection2014
Author(s)
Jen Chien P, Miyajima K, Munkhjargal M, Toma K, Arakawa T, Kudo H, Mitsubayashi K
Organizer
International Conference on BioSensors, BioElectronics, BioMedical Devices, BioMEMS/NEMS and Applications (Bio4Apps) 2014
Place of Presentation
Shanghai, China
Year and Date
2014-11-17 – 2014-11-19
