2015 Fiscal Year Annual Research Report
核輸送を介した転写因子およびエピジェネティック因子の制御と標的治療への応用
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26280108
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
金子 寛生 日本大学, 文理学部, 研究員 (10349946)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 生体生命情報学 / 発現制御 / 転写因子 / エピジェネティクス / 核輸送制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年までは、転写因子を中心とした研究を行ってきたが、27年度は、エピジェネティック因子の核内輸送機構の解明に向けた研究に着手した。エピジェネティック因子の核輸送については、世界的にもほとんど調べられていないので、どの因子を選びどのように研究を進めていくかがまず最初の大きな課題となる。そこで、がんとエピジェネティック研究の第一人者である名古屋市立大の近藤豊教授との共同研究を昨年度から開始してきた。その中で、我々は、研究対象をEzh2に絞り、核輸送について研究を行うことを決めた。Ezh2の輸送については、Ezh2の核局在化シグナル(Nuclear Localization Signal: NLS)が、アダプター分子としてのインポーチンαに結合し、さらにインポーチンβと結合して３者複合体を形成することにより核内輸送される"classicalな機構"を想定した。これに基づき、まず、Ezh2のNLSを特定する研究を開始した。アミノ酸配列に基づく解析の結果から、N末端側とC末端側の２箇所に、それぞれNLSが予測された。さらに、Ezh1のNLS予測結果との比較、Ezh2とEzh1の配列並置、リン酸化部位なども考慮し、多角的な解析を行った。この解析結果に基づき、近藤研究室でNLSのAla変異体の作製と核輸送実験を行った。その結果、予測した２箇所の NLS 領域のいずれも、単独ではAla 置換変異による輸送への影響がみられなかった。このことから、別のNLS もしくは二つの NLS 配列が補完的に働いている可能性が示唆された。
さらに、インポーチンα2遺伝子のノックダウンを行ったES細胞のマイクロアレイ解析結果を分析し、パスウェイ上に興味深い遺伝子をいくつか発見した。これらの遺伝子の変動について、リアルタイムPCR解析を用いて確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究開始前に作成した研究計画では、２年目以降の課題として、「エピジェネティック因子の核内輸送機構を解明する」「核輸送蛋白質インポーチンがエピジェネティック因子を標的遺伝子へ誘導することにも関与しているかどうかについて調べ、様々な関連分子群の相互作用を解明する」「遺伝子特異的/組織特異的に制御可能なエピジェネティック治療法を探索する」の３つを挙げている。これに対し、エピジェネティック因子については、ヒストン修飾酵素の１つであるEzh2の核内輸送の解明に向けた研究を当初の研究計画通りに開始することができた。
また、26年度の研究成果である「核局在化シグナル(NLS)の動的構造に関する網羅的解析」および「哺乳類のNLSの特徴解析」については、２報の論文としてまとめ報告することができた。26年度に行った「転写因子Oct3/4とインポーチンαの複合体構造の予測」については、さらなる解析と考察を加え、核内輸送から標的DNAへの受け渡しまでの一連のモデルを提唱するところまで発展させた。この内容を論文にまとめ現在投稿中である。「積み荷蛋白質が輸送蛋白質インポーチンαからリリースされる機構の解明」に関しては、連携研究者である医薬基盤研究所・米田悦啓博士と安原徳子博士に変異体の作製を中心とした実験に着手していただき、理論的予測を支持するデータを得ることができた。
さらに、来年度計画に向けて、治療法の開発を念頭においた準備を進めるため、産総研と共同でインポーチンαの機能を特異的に阻害する核酸アプタマーの検討を行った。
これらから総合的に判断し、27年度は当初計画通りおおむね順調に進展してしたと結論づけた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ここまでは、「研究実施計画」に従い、ほぼ順調に進展している。しかし、エピジェネティック因子の構造解析が当初の予想よりも世界的に遅れている。核内蛋白質は天然変性蛋白質であるケースが多く、転写因子やエピジェネティック因子などは、分子全体の構造を実験的に決定することが困難である。そのため、最終目標に向けて行う構造生物学的アプローチに基づく研究が遅れる可能性がある。すなわち、特定のエピジェネティック因子の機能阻害とそれに基づく発現制御を利用した治療化合物の設計と開発に影響を及ぼすであろうことに不安を感じている。
しかし、我々が研究対象としているEzh2についても完全ではないが結晶構造が出始めているのでその利用を考えていきたい。また近年、電子顕微鏡技術の著しい進歩により、原子レベルでの高解像な解析結果が盛んに出てきている。今年度初頭には、本研究課題の中心的テーマである核輸送と深い関係のある核膜孔複合体についても、電子顕微鏡により従来よりもはるかに精緻な構造情報が発表されている。転写因子やエピジェネティック因子を含む大きな複合体構造の知見も出てくることが期待される。このような環境の変化をうまく捉え、不完全な部分を計算で補完していくような実験データ重視型の研究スタイルを守っていきたいと考えている。
３年間で、転写因子の核輸送機構、エピジェネティック因子の核内輸送機構、核輸送後の標的遺伝子への誘導機構、それらを利用した治療法の開発などかなり多くのテーマを盛り込んでいる。前半の転写因子の核輸送機構だけでも複数の研究テーマを設定し、複数の研究成果を出せたことは喜ばしいことではあるが、内容が発散し、研究の方向性がぶれてしまわないように十分留意して進めていくことが必要と考える。
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| Causes of Carryover |
当初予定した博士研究員１名の人件費をフルではなく、パートとしたため、人件費が半分以下に削減された。今年度行った１回目の実験の外注費が予想外に高かったため、２回目の外注業者は変更することを検討した。慎重に業者を選定し、翌年に２回目の外注を依頼することにした。これにより、結果的には、貴重な研究費を有効に使えるようになると予測される。国費を使用した研究であるためできるだけ論文をオープンアクセスジャーナルに投稿するようにした。２本の論文がオープンアクセスジャーナルに掲載されたが、掲載料が当初予定よりも安くなった。最終年度には多くの化合物を使用した探索をする予定であり、莫大な研究費用が必要となるため、十分な予算を残しておく必要がある。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
パスウェイ解析をするための商用データベースを購入する。リアルタイムPCRなどの実験外注費や計算機で探索した化合物の購入費用など、検証実験のための費用が多くを占めることになる。最終年度のため、これまでの研究成果を論文発表するための英文校閲、投稿料や広報資料の作成のための費用が必要となる。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Molecular impairment mechanisms of novel OPA1 mutations predicted by molecular modeling in patients with autosomal dominant optic atrophy and auditory neuropathy spectrum disorder2016
Author(s)
Kazunori Namba, Hideki Mutai, Yoichiro Takiguchi, Hirotaka Yagi, Takahide Okuyama, Shuntaro Oba, Ryosuke Yamagishi, Hiroki Kaneko, Tomoko Shintani, Kimitaka Kaga, Tatsuo Matsunaga
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Journal Title
Otology & Neurotology
Volume: 37
Pages: 394-402
DOI
Peer Reviewed
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