2014 Fiscal Year Annual Research Report
疾患細胞ミトコンドリアへの分子送達を実現する遺伝子治療用ナノマシンの創製
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26282131
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
山田 勇磨 北海道大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (60451431)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 薬物送達システム / ミトコンドリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請研究では、ミトコンドリア (Mt)を標的とする遺伝子治療法を確立するため、疾患細胞Mtを標的とした遺伝子送達・発現を目的とする。Ｈ２６年度は、下記の項目を中心に研究を遂行した。
1. 微小管輸送を介したMt標的型キャリアの構築: 核酸をコアとするナノ粒子を形成し、細胞膜とMt膜を突破するために、エンベロープを多重構造化した新型のMITO-Porterを開発した。フローサイトメトリーおよび共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いた評価により、本キャリアがHeLa細胞、CAD細胞（神経モデル細胞）に効率的に取り込まれ、Mtへ送達される事を確認した。
2. Mt遺伝子発現pＤＮＡ（pHSP-mtLuc(CGG)）の構築および遺伝子発現能の検証： ＭｔでNanoLucタンパク質を発現するpHSP-mtLuc(CGG)の遺伝子発現評価のため、ネガティブコントロールとしてMtコドンにおいて翻訳停止となるストップコドンを有するpHSP-mtLuc (TAG)、プロモーターを有さないpmtLuc (CGG)を設計・構築した。これらの遺伝子をハイドロダイナミクス法を利用してラット骨格筋に導入し、NanoLuc発光活性を評価したところ、pHSP-mtLuc (CGG)はネガティブコントロールと比較して有意に高い値を示し、pHSP-mtLuc(CGG)がMtでの外来遺伝子発現を可能とするDNAベクターであることを明らかとした。
3．自主臨床研究の整備： Mt病患者由来細胞を提供して頂き研究を実施するために、自主臨床研究 『Mt病に対する薬物治療法確立に向けた検討』を北海道大学薬学部・北海道大学医学部・市立札幌病院の3施設に申請・承認を得ており、次年度以降の疾患細胞を用いた研究の遂行を可能とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
微小管輸送を介したMt送達を可能とする多重構造化した新型のMITO-Porterを開発に成功し、本キャリアがHeLa細胞、CAD細胞（神経モデル細胞）に効率的に取り込まれ、Mtへ送達される事を確認した。また、設計したＭｔでNanoLucタンパク質を発現するpHSP-mtLuc(CGG)がMtでの外来遺伝子発現を可能とするDNAベクターである事を明らかとした。微小管輸送を介したＭｔ送達検証に関しては未実施ではあるが、ここまでに示した内容はＨ２６年度に計画した全ての研究内容が網羅されており、研究の目的を達成する多くの成果を得ることができた。さらに、当初予定にはなかったが、自主臨床研究を整備し、種々の疾患細胞を用いた研究の遂行を可能とした。以上より、現在までの達成度は『当初の計画以上に進展している』と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は、『疾患細胞を用いたキャリアの細胞内動態の最適化』および『Mt応答性核酸ナノ粒子の構築および遺伝子放出の最適化』を中心に下記に記載した計画で研究を進める予定である。
① 疾患細胞を用いたキャリアの細胞内動態の最適化： 微小管を介したMt輸送を可能とする新型MITO-Porterの疾患細胞における細胞内動態を共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて観察する。遺伝子のMt送達は、定量的PCR法によって測定し最適化する。疾患細胞は、北海道大学・市立札幌病院より供与頂くmtDNA変異を有する患者由来細胞（正常細胞と比較して呼吸活性・膜電位が低い）を使用する。本研究実施のための自主臨床研究は既に承認されているため、準備は万全である。
② Mt応答性核酸ナノ粒子の構築および遺伝子放出の最適化： Mt内部は細胞内部と大きく環境が異なり、アルカリ性領域 (pH8.0)である。本申請研究ではヒスチジンを基本骨格とするポリマーを合成し核酸をナノ粒子化し、Mt内部での核酸放出能を評価する。中性環境で正電荷を有するヒスチジンは負電荷の核酸と静電的相互作用を介してナノ粒子を形成するが、アルカリ性環境下でヒスチジンの正電荷が消失するためMt内での核酸放出が期待できる。さらに、pHSP-mtLuc(CGG)をパッケージングしたMt応答性遺伝子発現ナノ粒子をDF-MITO-Porterに搭載し、生細胞Mtにおける遺伝子発現を検証する。転写過程は逆転写PCRによってMt内のmRNA量を定量、翻訳過程は発現したNanoLucタンパク質の発光を測定し評価する。また、Mt呼吸鎖タンパク質コードするMt内因性mRNAを標的とする“アンチセンスオリゴ核酸”も評価核酸として想定している。
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| Causes of Carryover |
平成26年度中に全額使用済みであるが、年度末に購入した物品費の支払いが本報告書の作成時点で反映されていないため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記のとおり、平成26年度中に全て使用済みである。
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[Journal Article] p62/SQSTM1 plays a protective role in oxidative injury of steatotic liver in a mouse hepatectomy model.2014
Author(s)
Sanae Haga, Takeaki Ozawa, Yuma Yamada, Naoki Morita, Izuru Nagashima, Hiroshi Inoue, Yuka Inaba, Natsumi Noda, Riichiro Abe, Kazuo Umezawa, Michitaka Ozaki.
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Journal Title
Antioxidants and Redox Signaling.
Volume: 21
Pages: 2515-2530
DOI
Peer Reviewed
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