• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2015 Fiscal Year Annual Research Report

疾患細胞ミトコンドリアへの分子送達を実現する遺伝子治療用ナノマシンの創製

Research Project

Project/Area Number 26282131
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

山田 勇磨  北海道大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (60451431)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords薬物送達システム / ミトコンドリア
Outline of Annual Research Achievements

本申請研究では、ミトコンドリア (Mt)を標的とする遺伝子治療法を確立するため、疾患細胞Mtを標的とした遺伝子送達・発現を目的とする。H26年度は、「1. 微小管輸送を介したMt標的型キャリアの構築」、「2. Mt遺伝子発現pDNAの遺伝子発現能の検証」、「3.自主臨床研究の整備」を中心に研究を遂行し、当初の計画以上に進展している成果を報告した。H27年度は、下記の項目を中心に研究を遂行した。

1. Mt発現pDNAベクターの改良: pHSP-mtLuc(CGG)封入MITO-Porterを構築し、HeLa細胞および疾患細胞を用いて検討したがMt遺伝子発現は確認されなかった。そのため、Mt発現pDNAベクターの改良に取り組み、pHSP-mtLuc (CGG)より40倍高いMt遺伝子発現能を有するpX-mtLuc (CGG)を開発する事に成功した。また、HeLa細胞を用いた検討においてMt遺伝子発現に最適な組成を有する新型のMITO-Porter-Xを開発し、培養細胞系でのMt遺伝子発現に成功した。
2. 疾患細胞を用いた細胞内動態評価: tRNAPheに点変異を有するMt患者由来の皮膚細胞の樹立・継代に成功した。本疾患細胞に従来型MITO-Porterを添加し、細胞取り込みおよび細胞内動態を観察した。その結果、これまでにHeLa細胞で観察された結果と同様にMITO-Porterが病態モデル細胞に取り込まれ、Mtに移行する事が確認された。
3. Mt応答性核酸ナノ粒子の構築: Mt環境応答性核酸ナノ粒子を構築するために、ヒスチジンを基本骨格とするポリマーを合成した。当初はpHSP-mtLuc(CGG)の核酸ナノ粒子を構築する予定であったが、pX-mtLuc(CGG)の開発に着手したためオリゴ核酸を用いたナノ粒子形成し、種々の検討を経て核酸放出能を最適化する事に成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定であった『疾患細胞を用いたキャリアの細胞内動態の最適化』の前に、pHSP-mtLuc(CGG)が培養細胞Mtにおいても遺伝子発現活性を有する事を検証したが、HeLa細胞および疾患細胞においてMt遺伝子発現は確認されなかった。そのため、キャリアを改良する前にMt発現pDNAベクターの改良に取り組み、pHSP-mtLuc (CGG)より高いMt遺伝子発現能を有するpX-mtLuc (CGG)を開発する事に成功した。また、HeLa細胞を用いた検討においてMt遺伝子発現に最適な組成を有する新型のMITO-Porter-Xを開発する事に成功した。当初予定していなかったこれらの研究成果は特許出願中である(現在、事業化を検討中である)。pX-mtLuc (CGG)のMt遺伝子発現能を最大限に引き出すMt送達用キャリアMITO-Porter-Xは従来型MITO-Porterの構成成分が基本骨格となっているため、標的とする疾患細胞を用いて従来型MITO-Porterの細胞内動態を評価した。その結果、MITO-Porterシステムは疾患細胞Mtへの移行が十分に可能である事が確認された。
これらの結果に基づき、疾患細胞へのMt送達にはMITO-Porter-Xを、遺伝子発現にはpX-mtLuc (CGG)を基盤としたシステムを構築するよう計画を再考した。計画の一部は変更しているが、ここまで示した内容は『疾患細胞Mtを標的とした遺伝子送達・発現』を目的に掲げる本研究を達成する有用な成果である。一方で、Mt環境応答性核酸ナノ粒子の構築に関してはオリゴ核酸を用いたナノ粒子形成にとどまっており、H28年度に遺伝子ナノ粒子に関する検討を開始する。以上より、現在までの達成度は『おおむね順調に進展している』と判断した。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は、『疾患細胞Mtにおける遺伝子治療戦略の検証』を中心に下記に記載した計画で研究を進める予定である。

① 疾患細胞を用いたMtを標的とした外来遺伝子発現の検証: pX-mtLuc (CGG)を搭載したMITO-Porterを構築し、疾患細胞Mtへの遺伝子導入・遺伝子発現を検証する。本申請研究では、自主臨床研究 『Mt病に対する薬物治療法確立に向けた検討』で樹立したtRNAPheに点変異を有するMt患者由来の皮膚細胞を用いる。本疾患細胞は、複合体III活性が低下しておりMt膜電位・ATP産生の低下が予想される。遺伝子発現検証に関しては、転写過程は逆転写PCRによってMt内のmRNA量を定量、翻訳過程は発現したNanoLuciferaseタンパク質の発光を測定し評価する。本検討を通じて疾患細胞における最適なMt遺伝子発現が可能なシステムを構築すべく、プラスミドDNAおよびナノキャリアの最適化を図る。

② 疾患細胞を用いた遺伝子治療戦略の検証: 疾患細胞Mtへの遺伝子導入・発現を最適化したMITO-Porterシステムに治療用DNAを搭載し、Mt遺伝子治療戦略の検証を試みる。治療用DNAの候補としては、疾患細胞の有する変異tRNAPheに対応する正常遺伝子をコードするMt発現型プラスミドDNAを使用し、これまで樹立したMt患者由来の皮膚細胞(tRNAPheに点変異を有し、複合体III活性の低下、難聴などの症状)を用いる。また、正常遺伝子をコードする治療用“RNA”も評価核酸として想定している。治療効果は複合体III活性、Mt膜電位、ATP産生量などを測定し評価する。

Causes of Carryover

平成27年度中に全額使用済みであるが、年度末に購入した物品の支払いが
本報告書の作成時点で反映されていないため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記のとおり、平成27年度中に全て使用済みである。

  • Research Products

    (24 results)

All 2016 2015 Other

All Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 6 results,  Acknowledgement Compliant: 6 results) Presentation (13 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Invited: 3 results) Book (1 results) Remarks (2 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Journal Article] Mitochondrial DDS Opens Innovative Pharmaceutics2016

    • Author(s)
      Yuma Yamada
    • Journal Title

      Yakugaku Zasshi

      Volume: 136 Pages: 55-62

    • DOI

      10.1248/yakushi.15-00227-3.

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Validation of a strategy for cancer therapy, delivering aminoglycoside drugs to mitochondria in HeLa cells2016

    • Author(s)
      Jiro Abe, Yuma Yamada, Hideyoshi Harashima
    • Journal Title

      Journal of Pharmaceutical Sciences

      Volume: 105 Pages: 743-740

    • DOI

      10.1002/jps.24686.

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Mitochondrial delivery of antisense RNA by MITO-Porter results in mitochondrial RNA knockdown, and has a functional impact on mitochondria2015

    • Author(s)
      Ryo Furukawa, Yuma Yamada, Eriko Kawamura, Hideyoshi Harashima
    • Journal Title

      Biomaterials

      Volume: 57 Pages: 107-115

    • DOI

      10.1016/j.biomaterials.2015.04.022.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] An analysis of membrane fusion between mitochondrial double membranes and MITO-Porter, mitochondrial fusogenic vesicles2015

    • Author(s)
      Yuma Yamada, Yutaka Fukuda, Hideyoshi Harashima
    • Journal Title

      Mitochondrion

      Volume: 24 Pages: 50-55

    • DOI

      10.1016/j.mito.2015.07.003.

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Validation of mitochondria gene delivery in liver and skeletal muscle via hydrodynamic injection using an artificial mitochondrial reporter DNA vector2015

    • Author(s)
      Yukari Yasuzaki, Yuma Yamada, Takuya Ishikawa, Hideyoshi Harashima
    • Journal Title

      Molecular Pharmaceutics

      Volume: 12 Pages: 4311-4320

    • DOI

      10.1021/acs.molpharmaceut.5b00511.

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] ミトコンドリアDDSが拓く医療・ライフサイエンス革命2015

    • Author(s)
      山田勇磨
    • Journal Title

      Drug Delivery System

      Volume: 30 Pages: 348-362

    • DOI

      org/10.2745/dds.30.348

    • Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Mitochondrial delivery of Coenzyme Q10 via systemic administration using a MITO-Porter prevents ischemia/reperfusion injury in the mouse liver2015

    • Author(s)
      Yuma Yamada, Kohei Nakamura, Jiro Abe, Mamoru Hyodo, Sanae Haga, Michitaka Ozaki, Hideyoshi Harashima
    • Journal Title

      Journal of Controlled Release

      Volume: 213 Pages: 86-95

    • DOI

      10.1016/j.jconrel.2015.06.037.

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] ミトコンドリア標的型インテリジェントナノデバイスを用いた遺伝子治療への挑戦2016

    • Author(s)
      山田勇磨、原島秀吉
    • Organizer
      第25回 インテリジェント材料・システムシンポジウム
    • Place of Presentation
      東京女子医科大学 先端生命医科学研究所 TWIns(東京都新宿区)
    • Year and Date
      2016-01-08 – 2016-01-08
  • [Presentation] ミトコンドリア遺伝子発現DNAベクターの設計および遺伝子発現評価2015

    • Author(s)
      石川卓哉、山田勇磨、原島秀吉
    • Organizer
      日本核酸医薬学会 第1回年会
    • Place of Presentation
      京都テルサ(京都府京都市)
    • Year and Date
      2015-11-30 – 2015-11-30
  • [Presentation] 癌細胞ミトコンドリアを標的としたアミノグリコシド系薬剤による癌治療戦略の検証2015

    • Author(s)
      阿部二郎、山田勇磨、原島秀吉
    • Organizer
      第15回日本ミトコンドリア学会
    • Place of Presentation
      福井県国際交流会館(福井県福井市)
    • Year and Date
      2015-11-19 – 2015-11-19
  • [Presentation] ゲンタマイシン搭載ミトコンドリア標的型DDSを用いたがん治療戦略の検証2015

    • Author(s)
      山田勇磨、阿部二郎、原島秀吉
    • Organizer
      第37回日本バイオマテリアル学会大会
    • Place of Presentation
      京都テルサ(京都府京都市)
    • Year and Date
      2015-11-09 – 2015-11-09
  • [Presentation] MITO-Porter, an innovative technology for mitochondrial drug delivery2015

    • Author(s)
      Yuma Yamada
    • Organizer
      The 1st HU-TMU-KU Joint Symposium for Pharm. Sci.
    • Place of Presentation
      北海道大学 (北海道札幌市)
    • Year and Date
      2015-08-29 – 2015-08-29
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] MITO-Porter, mitochondrial drug delivery system toward innovative therapy2015

    • Author(s)
      Yuma Yamada, Harashima Harashima
    • Organizer
      DRUG DELIVERY 2015, World Drug Delivery Summit
    • Place of Presentation
      Houston (USA)
    • Year and Date
      2015-08-18 – 2015-08-18
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Targeted mitochondrial delivery of functional nucleic acids using MITO-Porter2015

    • Author(s)
      Eriko Kawamura, Yuma Yamada, Harashima Harashim
    • Organizer
      42nd Annual Meeting & Exposition of the Controlled Release Society
    • Place of Presentation
      Edinburgh(Scotland, UK)
    • Year and Date
      2015-07-28 – 2015-07-28
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] In vivo mitochondrial delivery of coenzyme Q10 via MITO-Porter prevents ischemic reperfusion injury in the liver2015

    • Author(s)
      Yuma Yamada, Kohei Nakamura, Harashima Harashima
    • Organizer
      42nd Annual Meeting & Exposition of the Controlled Release Society
    • Place of Presentation
      Edinburgh(Scotland, UK)
    • Year and Date
      2015-07-28 – 2015-07-28
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ミトコンドリア標的型ナノマシン“MITO-Porter”の開発2015

    • Author(s)
      山田 勇磨、原島秀吉
    • Organizer
      第24回日本Cell Death学会 シンポジウム1
    • Place of Presentation
      大阪大学会館(大阪市豊中市)
    • Year and Date
      2015-07-11 – 2015-07-11
    • Invited
  • [Presentation] アミノグリコシド系薬剤による癌細胞内ミトコンドリアを標的とした殺細胞効果の検証2015

    • Author(s)
      阿部二郎、山田勇磨、原島秀吉
    • Organizer
      24回日本Cell Death学会
    • Place of Presentation
      大阪大学会館(大阪市豊中市)
    • Year and Date
      2015-07-11 – 2015-07-11
  • [Presentation] ミトコンドリアDDSが拓く医療・ライフサイエンス革命2015

    • Author(s)
      山田 勇磨
    • Organizer
      第31回日本DDS学会. 第7回奨励賞受賞講演
    • Place of Presentation
      京王プラザホテル(東京都新宿区)
    • Year and Date
      2015-07-03 – 2015-07-03
    • Invited
  • [Presentation] CoenzymeQ10搭載MITO-Porterの構築およびin vivoミトコンドリア送達・疾患治療戦略の検証2015

    • Author(s)
      山田勇磨、中村宏平、原島秀吉
    • Organizer
      日本薬剤学会 第30年会
    • Place of Presentation
      長崎ブリックホール(長崎県長崎市)
    • Year and Date
      2015-05-21 – 2015-05-21
  • [Presentation] アミノグリコシド系薬剤による癌細胞ミトコンドリアを標的とした癌治療戦略の検証2015

    • Author(s)
      阿部二郎、山田勇磨、原島秀吉
    • Organizer
      日本薬剤学会 第30年会
    • Place of Presentation
      長崎ブリックホール(長崎県長崎市)
    • Year and Date
      2015-05-21 – 2015-05-21
  • [Book] Innovative Medicine2015

    • Author(s)
      Michitaka Ozaki, Takeaki Ozawa, Yuma Yamada
    • Total Pages
      339(pp. 265-279)
    • Publisher
      Springer
  • [Remarks] 北海道大学 大学院薬学研究院 薬剤分子設計学研究室 HP

    • URL

      http://www.pharm.hokudai.ac.jp/yakusetu/

  • [Remarks] 北海道大学 大学院薬学研究院 HP

    • URL

      http://www.pharm.hokudai.ac.jp/

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 組換え発現ベクター及び当該ベクターを封入した脂質膜構造体2015

    • Inventor(s)
      原島秀吉、山田勇磨、石川卓哉、秋田英万
    • Industrial Property Rights Holder
      国立大学法人北海道大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2015-230498
    • Filing Date
      2015-11-26

URL: 

Published: 2017-01-06  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi