• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2014 Fiscal Year Annual Research Report

骨格筋のミトコンドリア呼吸活性を修飾する酸素輸送担体の新たな分子相互作用

Research Project

Project/Area Number 26282183
Research InstitutionKanazawa University

Principal Investigator

増田 和実  金沢大学, 人間科学系, 教授 (50323283)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords筋細胞 / 代謝 / ミトコンドリア / ミオグロビン / 運動
Outline of Annual Research Achievements

筋細胞内のMb量の多寡がミトコンドリアの呼吸活性に及ぼす影響については明らかにされていない。さらに、ミトコンドリアに内在するMbによる呼吸活性への貢献については全く検証が及んでいない。
そこで平成26年度では、Mb単独の影響を確認するために、Mbを安定的に過剰発現する培養細胞の樹立を進めた。Flagタグ付きMb発現ベクターを構築後、C2C12細胞にトランスフェクションした。この発現ベクターにはIRES配列を介してGFPも発現させることができるので、GFPを遺伝子導入の成否を判断する可視的なレポータとして観察した。また、遺伝子導入によって発現するFlagエピトープタグを融合させたMbも生化学的に確認した。分化誘導して得られた筋管細胞を回収し、ホモジナイズした。そのサンプルからFlag抗体によって特異的にMb-Flagを免疫沈降し、沈降サンプルを電気泳動によって分離し、ImmunoblottingによってMbやミトコンドリア構成タンパク質を検出した。分析の結果、Flagの免疫沈降サンプルからCOX-IVが検出された。COX-IVはミトコンドリアの複合体4を形成するサブユニットの1つであるので、C2C12細胞で強制発現させたMbがミトコンドリアにも局在していることが示された。また、Mbのミトコンドリアの相互作用の機能的意義を検証するため、高感度酸素電極を搭載した細胞代謝計測機を用いて、筋細胞のミトコンドリア呼吸活性(酸素消費速度)を計測する方法の確立を図った。ミトコンドリア呼吸活性の測定には培養筋芽細胞(C2C12)を対象とし、添加基質を変えることによってミトコンドリア呼吸鎖複合体毎に活性を評価した。樹立したFlag-Mb過剰発現細胞では呼吸活性が亢進する結果が得られた。次年度では、呼吸活性や酵素活性を含める表現型の変化について詳細に検証する予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年ではMbを安定的に過剰発現する筋細胞を確立することができた。また、その細胞のミトコンドリアタンパク質やMb量など、遺伝子改変細胞の特性も確認することができた。さらに、機能的変化を検証するシステム(高感度代謝測定機)を導入し、その稼働と分析方法の確立を進めつつ、培養細胞を用いてMbの多寡による細胞呼吸機能の変化を検証することができた。これらの推進事項は当初予定していた推進項目であり、次年度にさらに分析の積み上げを行うつもりである。

Strategy for Future Research Activity

〔Mbに相互作用するミトコンドリアタンパク質の同定〕
平成26年度の研究内容を継続しつつ、更に詳細に呼吸活性に関する表現型の変化について検証を進める。また、樹立したStable C2C12を用いて共免疫沈降法(Co-IP)やプルダウンアッセイなどによってMbとミトコンドリアの共局在の有無を検討する。また、ショットガン解析(質量分析)によるミトコンドリア関連タンパク質の探索:プロテオーム解析を試みる。我々のこれまでの経験では、Mycタグ付きMb過剰発現L6を用いた質量分析では、Myc-Mbの沈降物からミトコンドリア関連タンパク質が検出された。ただし、L6にはミトコンドリアが少ないことやMyc-Mbの回収効率が疑われたために、本研究ではC2C12への変更(L6→C2C12)と、タグの変更(Myc→Flag-タグ)によって安定的な実験結果を得ることを目指す。プロテオーム解析を通じてMbがどのようなミトコンドリア関連タンパク質と相互作用し、複合体を形成しているのか検証する。また、同定されたタンパク質の過剰発現(発現ベクターの導入)や発現抑制(shRNAの導入)のC2C12を作成して、Mbとの相互作用の有無がミトコンドリアの機能に及ぼす影響を検証する。さらに、平成28年度の研究内容(骨格筋Mbの発現調節機構)についても可能な限り検証を進める予定である。
なお、我々は摘出骨格筋においてMbとミトコンドリアの複合体IVを構成するCOX IVとの相互作用の可能性を推測している。Mbとミトコンドリア関連タンパク質を同定することは、Mbが持つ新たな生理機能を相互作用の視点から明らかにできることを期待している。

  • Research Products

    (10 results)

All 2015 2014 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 2 results) Presentation (7 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Endurance training facilitates myoglobin desaturation during muscle contraction in rat skeletal muscle2015

    • Author(s)
      Takakura H, Furuichi Y, Yamada T, Jue T, Ojino M, Hashimoto T, Iwase S, Hojo T, Izawa T and Masuda K
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 5: 9403 Pages: 1-7

    • DOI

      10.1038/srep09403

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] 脂肪酸による骨格筋のミトコンドリア生合成機構2015

    • Author(s)
      石澤里枝, 山田達也, Hamidie DR Ronald, 増田和実
    • Journal Title

      北陸体育学会紀要

      Volume: 51 Pages: 41-54

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] New insights for the factor regulating muscle mitochondrial respiration2014

    • Author(s)
      Yamada T, Thomas Jue T and Masuda K
    • Organizer
      Cell Symposia System approach to Metabolic Diseases
    • Place of Presentation
      Chicago, IL, USA
    • Year and Date
      2014-10-01 – 2014-10-03
  • [Presentation] Pgc-1αの発現抑制がミオグロビン発現量に及ぼす影響について2014

    • Author(s)
      高倉久志, 田中誠智, 田中剛貴, 加藤久詞, 柴原拓哉, 増田慎也, 岩中伸壮, 北條達也, 稗田睦子, 井澤鉄也, 増田和実
    • Organizer
      第69回日本体力医学会大会
    • Place of Presentation
      長崎大学, 長崎
    • Year and Date
      2014-09-19 – 2014-09-21
  • [Presentation] 骨格筋ミトコンドリアの呼吸調節機序に関わる新規知見2014

    • Author(s)
      山田達也, 石澤里枝, Hamidie DR Ronald, 増田和実
    • Organizer
      第69回日本体力医学会大会
    • Place of Presentation
      長崎大学, 長崎
    • Year and Date
      2014-09-19 – 2014-09-21
  • [Presentation] Caffeine treatment stimulates myoglobin synthesis via cAMP signaling in L6 skeletal muscle cells2014

    • Author(s)
      Iwanaka N, Yokokawa T, Fujita T, Masuda K and Hashimoto T
    • Organizer
      ACSM Conference on Integrative Physiology of Exercise
    • Place of Presentation
      Miami Beach, FL, USA
    • Year and Date
      2014-09-17 – 2014-09-20
  • [Presentation] Curcumin treatment augment exercise effect on mitochondria biogenesis in skeletal muscle and myocardium2014

    • Author(s)
      Hamidie DRR, Ishizawa R, Yamada T, Nitta S and Masuda K
    • Organizer
      American College of Sports Medicine 61st Annual Meeting
    • Place of Presentation
      Orland, FL, USA
    • Year and Date
      2014-05-27 – 2014-05-31
  • [Presentation] Enhanced respiration with myoglobin interaction in mitochondria2014

    • Author(s)
      Masuda K, Yamada T and Jue T
    • Organizer
      American College of Sports Medicine 61st Annual Meeting
    • Place of Presentation
      Orland, FL, USA
    • Year and Date
      2014-05-27 – 2014-05-31
  • [Presentation] PGC-1α expression is not essential for endurance training induced increase in myoglobin expression in skeletal muscle2014

    • Author(s)
      Takakura H, Tanaka G, Tanaka S, Kato H, Shibahara T, Masuda S, Iwanaka N, Hata T, Izawa T, Jue T and Masuda K
    • Organizer
      American College of Sports Medicine 61st Annual Meeting
    • Place of Presentation
      Orland, FL, USA
    • Year and Date
      2014-05-27 – 2014-05-31
  • [Remarks] 金沢大学運動生理学・生化学研究室HP(増田研究室)

    • URL

      http://exercisephysiol.com

URL: 

Published: 2016-06-01  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi