2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of New Strategy of Protein Design Based on Single Phage Sorting Technique
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26282213
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
高橋 聡 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30283641)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂本 清志 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (30335228)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ファージディスプレイ / 一分子ソーター / GFP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、少しずつアミノ酸配列が異なるタンパク質を提示したファージのライブラリーの中から、特定の特性を持つタンパク質を提示したファージを、蛍光強度を手がかりに選別する手法を確立すべく計画した。昨年までの研究で、ファージ一個体あたりの蛍光が十分ではなかったことにより、選別を難しくしていることを見いだし、強い蛍光を発するファージを作製した。すなわち、昨年まではファージ一個体あたり5個存在する外殻タンパク質であるg3pに緑色蛍光タンパク質を提示した。しかし、5個のGFPでは十分な蛍光強度が得られなかったため、ファージ一個体あたり2700個存在するg8pにGFPを提示するデザインに切り替えた。特に、ヘルパーファージシステムを用いることでg8pの一部にのみGFPを提示さることで、十分に安定でしかも100倍以上の蛍光強度をもつファージを作製した。
上記の努力と並行して、一分子蛍光観察装置の感度を上げるために光学系の全面的な改良を行った。特に、感度低下の主要因が背景光にあることを見いだし、自家蛍光の少ない石英対物レンズへの交換、二点観測を諦めて一点での感度の高い観測を行う光学系として光軸のやり直したことで、背景光を劇的に減らしながらも、蛍光感度を向上させることに成功した。改良した装置を用いて強く光るファージを流すことで、ファージ一個体ごとに選別して測定し、その多くを大腸菌培地に回収し、コロニーを作らせることに成功した。
今回用いた蛍光ファージは、分割型GFPに基づいている。ファージの表面における分割型GFPの再構成過程を調べたところ、再構成過程はファージの存在に大きく左右され、場合によっては発光を始めるまでに長い時間が必要であることがわかった。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Significant Heterogeneity and Slow Dynamics of the Unfolded Ubiquitin Detected by Confocal Method of Single-Molecule Fluorescence Spectroscopy2016
Author(s)
Masataka Saito, Supawich Kamonprasertsuk, Satomi Suzuki, Kei Nanatani, Hiroyuki Oikawa, Keiichiro Kushiro, Madoka Takai, Po-Ting Chen, Eric Hsin-Liang Chen, Rita Pei-Yeh Chen, Satoshi Takahashi
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Journal Title
J. Phys. Chem. B
Volume: 120
Pages: 8818-8829
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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