2015 Fiscal Year Annual Research Report
構造化照明を利用した超解像ラマンイ分光イメージング技術の開発
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26286063
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤田 克昌 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80362664)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ラマン分光 / 光学顕微鏡 / 超解像顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラマン顕微鏡は、分子や結晶の格子振動を検出できるため、染色することなくとも、試料中の物質を同定しながら、その空間分布を画像化できる。材料科学、デバイス工学から生物学、創薬まで幅広く利用されているが、顕微観察における空間分解能は光の波長程度に限られてきた。他の光学顕微鏡に比べて、信号光が微弱であるため、空間分解能の向上は困難とされてきた。
今年度は、昨年度までに試作した構造化照明を用いた高解像度撮像が可能なラマン散乱顕微鏡の結像特性の評価、および各種材料観察への応用を検討した。微小粒子を試料に用いた観察により、その空間分解能は200nm以下であり、検出した光の波長（580nm前後）の半分以下の空間分解能が得られた。しかしながら、この値は理論限界には達しておらず、更に空間分解能を向上できることが分かった。また、開発した空間分解能の向上が多種の物質からなる試料の分析においても有効であることを確かめるためポリマー材料、カーボン材料、生体組織の観察を行い、得られたラマンスペクトルから、各材料をより正確に分離でき、その空間分布を観察像として得られることを確認した。
生体試料をより高い空間分解能、分析力で測定するための冷却ステージの検討も進めた。微弱なラマン散乱を効率良く検出するために、高い集光効率をもつ高開口数レンズが使用でき、かつ焦点位置を長時間保持することが可能な冷却ステージを新たに設計した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、構造化照明を利用することによりラマン散乱顕微鏡の空間分解能を向上することを第1の目的とし、さらに、各種試料の分析、観察への応用を通して開発した手法の有用性を確認することを第2の目的としている。昨年度までに、ラマン散乱顕微鏡の空間分解能を向上するための理論構築、試作機の開発を行い、提案する手法がラマン散乱顕微鏡の空間分解能を向上できることを実験的に確認した。本年度は、試作したラマン散乱顕微鏡の空間分解能を定量的に測定し、装置の評価および改善方法の検討、および、各種材料からなる試料観察へ応用した際の分析力についての定性的な評価を行った。
空間分解能の評価は、直径40nmの蛍光ビーズを試作した顕微鏡で観察した際の像の広がりから求めることにより行った。その結果、約190nmの空間分解能が得られ、従来の手法に比べ約1.8倍の空間分解能の向上が達成されていることがわかった。しかし、空間分解能はさらに1.4倍程度大きくできることが、理論的には示唆されており、現在のシステムでは、撮像光学系、および照明パターンの形成法を改善すれば、空間分解能が向上することが分かった。
応用面については、PMMA/ポリスチレンからなる混合試料、CVDグラフェン、グラファイト片、マウス脳組織の観察を開発した顕微鏡により行った。どの試料においても空間分解能の向上が確認された。さらに、空間分解能の向上により、ラマンスペクトルの空間的な重複が少なくなり、試料中の物質の認識力が向上することが分かった。グラフェンの観察結果では、複数のラマンバンドの相関がはっきりと確認でき、分析能力の向上も確認できた。
特に生体試料においては試料の損傷を抑えながら、長時間の観察が必要となる。そこで顕微鏡用冷却ステージの設計を行った。微弱なラマン散乱光を捉えるために、高開口数レンズで使用可能な冷却ステージを新たに設計した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降は、以下について研究開発を進める。
１，空間分解能の向上
これまでの研究により光学系の改善によりさらに空間分解能の向上が見込まれることが判明した。そこで、試料を照明するための光パターンを検討し、異なるパターンにおける空間分解能を計算することで、本光学系に適した照明パターンを求める。また、照明パターンの形成ついても、新たな光学系を設計し、装置に導入する。また、結像光学系においては、収差のより少ないレンズ分光器を導入し、結像特性の向上を図る。
２．生体試料の凍結観察
生体試料をより生きたままの状態で長時間観察するために、凍結させた試料の観察を可能とする冷却ステージを組み込む。実際に、細胞試料を観察することにより、細胞の状態（例えば、ヘムタンパク質の酸化還元状態）を保持したままラマン散乱計測が可能であることを調べる。また高解像度ラマン散乱観察を行い、細胞中の生体分子の分析力についても定性的に評価を行う。
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| Causes of Carryover |
基金分は顕微鏡用の冷却ステージの購入のために活用を予定していた。しかしながら、市販の冷却ステージでは要求される仕様を満足できないことが分かり、独自仕様のものを設計し、特注品として購入することにした。設計は当初の予定から時間がかかり、納期が次年度にずれ込むことになったため、今年度は基金分の使用を行わないことにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
特注品として購入する冷却ステージの仕様検討、設計は終了しており、次年度の前半には基金分の予算を利用して購入する予定である。購入スケジュールに遅れが生じたが、顕微鏡改善の検討を前倒しで開始できたため、研究自体の進捗には問題は無い。
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