2014 Fiscal Year Annual Research Report
極低摩擦生体類似摺動組織の形成および機能評価技術の構築
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26289029
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
澤江 義則 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10284530)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 哲生 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (20466783)
森田 健敬 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (70175636)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞・組織 / 低摩擦 / 関節軟骨 / トライボロジー / 再生医療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
足場材に軟骨細胞を播種した培養組織試験片に対し，試験片表面とローラーの摺動による力学的負荷を加えながら培養する，「摺動負荷培養装置」を開発した．本研究では，足場材内部に摺動による不均一な応力場を形成し，内部の個々の軟骨細胞が曝される応力場と，その細胞が周囲に形成する組織構造との関係を明らかにすることを目指している．そのためこの装置では，ガラス製ローラーと接触する矩形の培養組織試験片の幅を，ローラー幅よりも小さくし，ローラーとの接触により培養組織試験片内に生じる応力分布が，線接触に関するヘルツの接触理論により記述可能な二次元的なものとなるようにした．培養組織試験片を浸漬した培養皿は試料ステージ上に固定し，ガラスローラーに対しこの試料ステージを上下させることにより，試験片上面とローラーとを接触させ初期押し込みを与える．またローラーの往復回転と試料ステージの前後動をそれぞれ独立したサーボモーターで行うことにより，滑り率＝0の純転がりから滑り率＝１の純滑りまで，滑り率の異なる摺動を培養組織試験片に加えることが可能である．
摺動負荷培養装置の製作と平行し，1MPa程度の実用的機械的強度を持った培養組織を得るための高細胞密度培養技術の検討を行った．まず，足場材であるアガロースゲルのアガロース濃度を従来の2 wt%から1 wt%まで希薄化し，初期細胞濃度1億 cells/mlでの高細胞密度培養における細胞生存率と組織形成を検討した．その結果，3週間の培養において，組織試験片中心部における著しい生存率低下が認められた．このため，アガロースを足場材として高細胞密度培養を行うには，繰り返し圧縮変形あるいは流体圧によるパフュージョン効果により物質輸送を促進する必要があると判断された．また高細胞密度培養に充分な数の軟骨細胞を安定して確保するため，細胞源の変更を検討開始した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度の計画の内，摺動負荷培養のための力学負荷培養装置の開発については，予定通りに完了し，足場材としてアガロースを使用した培養組織試験片を用いた予備実験を開始することができた．3週間の培養を目標とした予備実験では，繰り返し摺動による試験片の損傷も見られたことから，現在，損傷を起こさずに3週間程度の培養が可能な負荷条件の検討を進めている．また同様に，強度面からの足場材料の検討も進めている．
もう一つの実施項目であった高弾性率培養組織形成のための細胞培養プロトコルの検討については，足場材であるアガロースゲル濃度，足場材に播種する初期細胞密度に関する検討を進めてきた．しかし，充分な細胞生存率の維持と高弾性率の獲得にはまだ成功していない．これは当初の想定の範囲であり，現在も継続して細胞源の変更と足場材材質の変更について検討を進めている．
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画に従い，本年度は顕微鏡視野下において培養組織の摩擦・変形特性を評価するための実験システムを構築する．既存の倒立型顕微鏡の観察ステージ部に，剛性の高い試験ステージを設置し，そのステージ上に，培養組織とガラス円筒間の摩擦試験を行う小型往復動摩擦試験機を設置する．この摩擦試験機の設計においては，培養組織とガラス円筒の間に生じる接触荷重と摩擦力が微小であることが予測されるため，これを高感度に測定することが可能な摩擦測定系を構築する必要がある．そのため，荷重および摩擦測定用の平行板バネを高精度な放電加工により作成し，その変位をレーザー変位計により測定することとする．また培養組織内に分布する細胞を蛍光染色し，これをマーカーとして摩擦試験時に培養組織内に生じる歪み分布を計測する．このために必要となる蛍光共焦点画像取得システムを購入し，倒立型顕微鏡観察ポートに設置する．
高弾性率培養組織形成のための細胞培養プロトコルについても継続して検討を進める．今年度は高細胞密度培養に必要となる軟骨細胞数を安定して確保するため，細胞源を従来の牛軟骨組織から単離した初代軟骨細胞から，株化した軟骨細胞前駆細胞へと変更することを検討する．そのために，前駆細胞を分化誘導し軟骨細胞を得る手法を研究室内に構築する．またこれまで用いてきたアガロースゲルでは高細胞密度培養での細胞生存率が十分に確保されないため，これに代わる足場材を検討する．今年度はアルギン酸ゲルとキトサンゲルについて，初期細胞密度1億 cells/mlでの培養試験を行い，生存率維持のために必要なゲル濃度等を検討する．
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| Causes of Carryover |
研究室の持つ既存装置の一部に不要部品が生じたことに加え，終了した他の研究プロジェクトから実験装置の譲渡を受けることが出来たことから，本年度実施した「摺動負荷培養のための力学負荷培養装置の開発」に当たり，それらから回収した機械部品，電気・電子部品を流用することで開発費を抑制することが出来た．そのため，次年度使用額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度発生した次年度使用額については，次年度に行う「顕微鏡視野下における培養組織の摩擦・変形特性評価システム」開発に際し，予定していた計測機器の一部をより高精度な製品に置き換え，測定精度の向上を図るために使用する．
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