2014 Fiscal Year Annual Research Report
マイクロ・ナノ電気穿孔法による細胞核への分子導入法の開発
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26289035
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
新宅 博文 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (80448050)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小寺 秀俊 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20252471)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 電気穿孔 / 動電現象 / 生体高分子 / 細胞 / マイクロ流体 / 物質輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はA20(mouse lymphocyte), K562 (human immortalised myelogenous leukemia line)およびプライマリーサンプルを用いて電気穿孔の実施と生体高分子の膜透過性について検討した．細胞の大きさ，溶液の電気電導性等に応じて電場あるいはマイクロ流体システムのデザインを調整することでそれぞれの細胞に応じた電気穿孔条件を与えることができた．電気穿孔に続く直流電場の印可については，すべての細胞について同様の条件を与えたが，試作したマイクロ流体システムは概ね再現性良く機能することが確認できた．ただし，特に直径の大きな細胞に対して試作したマイクロ流体システムにおいて，流路断面積を増加させたことに伴い電場による流れと比較して水頭差による流れが無視できなくなり，流れの制御が困難であった．この点を改善するため，今後流路構造の最適化を行う計画である．また，2色の蛍光を同時かつ個別に計測できる光学顕微鏡システムを構築し，それぞれの蛍光を発するトレーサ粒子を用いたマイクロPIV(Particle Image Velocimetry)法を確立した．本方法は，光学系により二つの励起光の導入と二つの蛍光を同時に観察できるシステムであり，これにより，電場により誘起されるマイクロ流れのダイナミクス計測が可能になった．ここで開発した可視化技術を応用して，等速電気泳動を用いたDNA分子とマイクロビーズの反応促進技術を解析し，DNA分子およびマイクロビーズの濃縮領域における混合現象を明らかにした．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り，2色の蛍光を同時かつ個別に計測できるシステムを構築し，それぞれの蛍光を発するトレーサ粒子を用いたマイクロPIV(Particle Image Velocimetry)を実現した．これにより，電場により誘起されるマイクロ流れのダイナミクス計測が可能になった．ここで開発した可視化技術を応用して，等速電気泳動を用いたDNA分子とマイクロビーズの反応促進技術を解析し，DNA分子およびマイクロビーズの濃縮領域における混合現象を明らかにした．一方，電気穿孔を実施した直後に直流電場を印可する方法により，電気泳動による細胞膜を介した分子輸送が行えることを明らかにした．本技術を応用して，一細胞からcytoplasmic RNAを抽出する技術を開発し，一細胞の前処理技術として提案した．
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光プラスミド，RNAおよびDNAを用いて，細胞膜あるいは核膜を介した生体高分子の輸送過程を可視化する．本年度は，特に細胞膜を介した生体高分子の輸送現象を重点的に解析する．バルク電気穿孔法において比較的大きな生体高分子は細胞膜を直接透過できず，電場印可時に一旦細胞膜と相互作用し，その後エンドサイトーシス状のプロセスで透過すると報告されている．一方で，オリフィスを用いたマイクロ・ナノ電気穿孔法では生体高分子が電気泳動により細胞膜および核膜を透過することが示唆されており，ここではこの電気泳動による高分子透過現象の物理メカニズムについて詳細に検討する．オリフィス構造の形成する集中電場が電気穿孔および分子の膜透過において重要な役割を果たしていると考えられることから，オリフィス周辺の電場計測および微小電流計測に基づく穿孔ダイナミクス解析を行いながら詳細を議論する．この際，オリフィスと細胞の固定状態あるいは核膜とオリフィスの位置関係も細胞膜および核膜における分子透過性を左右するため，細胞内小器官とオリフィスの位置関係を可視化により確認しながらこれらの実験を実施する．
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| Causes of Carryover |
購入を計画していた実験に必要な資材の年度内の納品が直前に困難になったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験に必要な資材の購入に利用する。
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