2015 Fiscal Year Annual Research Report
人工細胞膜を用いた極微小バイオ溶液ハンドリング技術の展開
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26289038
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
鈴木 宏明 中央大学, 理工学部, 教授 (20372427)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | リポソーム / フェムトリットル / 溶液操作 / 人工細胞膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マイクロサイズの液滴やマイクロチャンバーといった微細な化学・生化学反応容器の技術は，１細胞レベルの遺伝子発現解析やそのばらつき（細胞の個性）の計測といった生命科学の新しいフロンティア開拓の推進力となった．マイクロ流体技術の黎明期では，細胞や反応液を微細な空間に閉じ込めてそのダイナミクスを観察するという静的なものであったが，近年では巧妙なマイクロデバイスを駆使して液滴を動的に操作し，溶液の添加や分注（分割）といった，生化学実験者が研究室のベンチで行う標準操作がマイクロスケールで実現可能となった．
本研究では，申請者がこれまでに開発した，リポソームを動的反応容器として用いる技術を改良・発展させ，フェムトリットル体積の溶液添加→混合→分割といった連続操作，それを用いた逐次反応が可能な超微細生化学実験基盤技術を確立することを目指した．
申請時には，以下の２つの目標を掲げた．①インクジェット装置を利用し，均一なマイクロ反応場としてのリポソームを簡便に作製する②リポソームの融合と分裂の効率を上げ，かつ逐次的な生化学反応を継続可能とする
①については，2014,2015年度と引き続き取り組んでいるものの，水滴が油水界面を通過するときの不安定性問題がいまだに解消しておらず，当初の計画通りには進んでいない．2015年度は，系の温度と油の種類の影響をそれぞれ入念に調べたが，実験ごとのばらつきが大きく，安定してリポソームを得る条件を確立するにはいたっていない．②については，アガロースゲルで安定化したリポソームの融合と分裂の条件検討を入念に進め，ほぼ100%の確率でリポソームを完全分離する方法を隔離した．加えて，細胞内の基本的な反応であるDNA増幅反応を本プラットフォームで扱うための基礎的検討も行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要で述べたように，研究項目①については当初の予定通りに進んでいない．リポソームの内封液となる一定体積の水溶液をインクジェットノズルから吐出し，オイルと水の界面に形成した脂質の単分子膜を通過させることで微小反応場としての巨大リポソームが得られると予想した．しかし，水滴が脂質界面を通過するかどうかという点について，実験の日間誤差が非常に大きかった．この誤差の原因は，いまだに特定できていない．安定した界面通過によりリポソーム作製条件を目指し，温度の影響と使用したオイルの種類の影響を入念に調べた．温度が高く，かつオイルは多数の二重結合を持ちバルクの粘性が低いスクアレンを用いると，リポソームの形成率の上昇が見られたが，それでもリポソームに変換される効率は1%以下であった．
研究項目②については，モノアシル脂質(LysoPC)を溶液中に添加することで，ほぼ100%の効率で分裂変形が起き，かつ娘リポソームの分離を実現する条件を確立した．さらに，本リポソームプラットフォームを用いた生化学反応操作の実証実験として，ゲノムDNAの増幅反応に関する基礎的条件を確立した．
以上，やや遅れている項目と，計画以上に進展した項目が共存するため，おおむね順調に進展していると評価した．
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| Strategy for Future Research Activity |
2016年度は，インクジェットを用いた人工細胞膜（リポソーム）形成法の条件検討を継続して行う．水と油の界面における，レンズ状になった水滴に働く界面張力と重量のバランスを力学的に解明することが必要だと考えている．そのためには，界面張力を実際に計測する必要があるため，その装置購入または外注による計測を検討中である．かつ，脂溶性の非イオン性界面活性剤であるSpan80等をリン脂質に添加することで，膜形成の安定化を図る．
平行して，フェムトリットルの溶液を添加（融合）および分割（分裂）を高効率で行うための詳細な条件検討を継続する．内部にゲルを含むリポソームと，含まないリポソームの両条件において，融合と分裂の成功率を向上させる．前者は，ゲルのメッシュサイズよりも小さい小分子のみをハンドリングに適している．または，酵素がゲルマトリックスに封止されたリポソームとし，安定した微細環境場を提供できる．後者は，リポソーム内液の高分子が自由に拡散できるため，どのような反応にも適用可能であるが，操作の安定性に難がある．それぞれの適用範囲を条件検討により明らかにする．
以上の研究を組合せて，リポソームを用いた極微量溶液操作系を完成させる．
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| Causes of Carryover |
計画していた国際会議参加をとりやめとしたため，その旅費分を持ち越した
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
持ち越し分は旅費として使用する
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