2015 Fiscal Year Annual Research Report
「血統書付き」スーパーiPS細胞の選出と培養システムの開発
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26289065
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
劉 莉 京都大学, 物質－細胞統合システム拠点, 助教 (50380093)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
陳 勇 京都大学, 物質－細胞統合システム拠点, 教授 (70512458)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ナノファイバー / マイクロ流路 / 幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在のiPS細胞作製技術では、大量に採取した体細胞に対して複数の初期化遺伝子を導入し、そこから生成してくるコロニーを増殖・培養することによりiPS細胞を得ている。従って，得られるコロニーが単一クローンである保証はなく、むしろ由来の異なる細胞が異なる初期化を受けて得られたヘテロな集団と考えるべきである。このことは，創薬においては研究の再現性に、再生医療においては安全性に，深刻な影響を与える。本研究は、ナノファイバー上では単一iPS細胞が増殖できるという申請者らの発見を応用し、マイクロエンジニング技術を用いて、初期化操作により得られたiPS細胞コロニーから単一細胞を分離・隔離して分化させる手段を開発することを目的としている。これにより、由来が明確な細胞による基礎実験・創薬研究を可能にするとともに、クローンを大量培養することにより、安全な再生医療への道を開拓する。すなわち、「血統書付き」のヒトiPS細胞および分化細胞の提供を実現する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、初期化した細胞塊から単一細胞を分離して、細胞の由来が明確なiPS細胞コロニーの作製および分化細胞の生存環境を見出すため、培養システムを開発し、iPS細胞を利用した創薬や再生医療への新たなツールを提供することを目的とする。
最初年度、元々計画した”地球ー衛星”マイクロ流体デバイスシステムでシングルで実行したが、シングル細胞の単離は成功したが、シングル細胞からコロニーまでの培養成功率は低いため、培養システムはマイクロ流体デバイスから開放式マイクロウェールに変更した。その結果、単一細胞の中、３０％のシングル細胞からコロニーまで培養成功できた。
昨年度、以上の方法で樹立された複数の細胞株の多能性評価を行い、ナノファイバー上で長期培養した後、これらのiPS細胞株の多能性能を有することを確認した。驚くことは、これらの細胞株から、明らかに形態は異なった２つ（Dome-like, Monolayer）細胞タイプを発見した。２つタイプの細胞の違いを比較するために、RNA-Seqを行った。その結果、20000個遺伝子の中、3000以上の遺伝子の発現レベルの差があったことをわかった。これらの遺伝子を解析した結果、２種類の細胞の形成は細胞培養する基板の接着状態と関与していることは明らかになった。現在、そのメカニズムを追求するため、いくつ細胞情報伝達回路との関連性を調べている。
さらに、細胞株を保存するために、細胞にダメージが与えず、安全な保存法を検討して成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 予想外に、昨年度シングル細胞由来のhiPS細胞株を樹立した結果、２つ（Dome-like, Monolayer）細胞タイプを発見した。そのメカニズムを解明するところ、細胞培養する基板との接着状態は明らかに違うことを判明した。この現象を解明するため、いくつ関係がありそうな細胞情報伝達回路を調べる予定。見つけた伝達回路の正確性を検証するために、RNAiや抑制剤を投入することによって、評価を行う。
(2) 今後、樹立された複数の細胞株を目的細胞へ分化誘導し、細胞の分化能の違いを比較する予定。具体的に、本研究課題の連携者である中辻教授の研究グループでは、化合物による新規心筋細胞誘導法を開発した。既知の心筋分化促進分子より非常に強い効果を持っており、安定で高効率な臨床グレードの心筋分化誘導法（~98%）を世界で初めて開発している(Minami, et. al., 2012, Cell Report)。一方、肝臓細胞の分化誘導法はいくつ樹立されたが、未熟かつ機能性が低い肝臓細胞しか得られないため、実用には困難である。本年度は、過去２年で樹立した新規単一細胞培養法で選別された優良なiPS細胞を用いて、化合物誘導法により心筋細胞や肝臓細胞を分化誘導させてみる。
(3) 申請者らが開発したゼラチンナノファイバー技術を活かして、新規折りたたみファイバーシートを開発した。これを用いた3次元ヒトES/iPS細胞の大量培養に成功した(投稿中)。今年度余裕があれば、遺伝子レベル解析の結果による選別されたスーパーヒトiPS細胞を目的細胞に分化誘導させ、折りたたみファイバーシート上での大量培養実験を行う。
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| Causes of Carryover |
実験をサポートする適切な人材を見つからなかった。実験について、今年度通りに進んでいたが、見出した最適化条件で再現性を確認はまた完了していない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
来年度最適化されている条件でデバイスの再現性を確認する予定。引き続き実験をサポートする適切な人材を探している。
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