2014 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト由来膜タンパク質の磁性粒子上での機能発現に向けたIVD法の開発
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26289308
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
吉野 知子 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30409750)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 義昌 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (30711155)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 磁性粒子 / 膜タンパク質 / in vitro docking / 細胞内区画 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ターゲット膜タンパク質と磁性細菌粒子の双方に、ドッキングタンパク質を融合し、細胞の異なる区画で発現させる。これにより細胞破砕後に細胞外でin vitroドッキングが進むように設計する。平成26年度では、このin vitroドッキングに利用可能なドッキングタンパク質の評価に注力した。まず、IgGのFc領域と抗体結合タンパク質Protein AのZZドメインの相互作用が、in vitroドッキングにおいて有効であるか検証した。磁性細菌粒子上のMms13にZZドメインを融合し粒子上にディスプレイした。一方で、Fc部位にはペリプラズム輸送シグナル配列、および粒子上へ固定化するタンパク質のモデルとして単鎖抗体を融合した。破砕時に、粒子画分とペリプラズム画分が混合するよう設計したところ、in vitroドッキングのメカニズムに従い、粒子上へ単鎖抗体が固定化されることを確認した。さらに発現誘導システムにより単鎖抗体融合タンパク質の発現量を調整することにも成功している。来年度は、本システムによる粒子上への単鎖抗体固定化量の制御を確認する。また、ZZドメイン・Fc部位のペア以外にも利用可能なドッキングタンパク質として、種々のセルロース分解菌で見られる安定なタンパク質複合体であるドックリン・コヘシンの利用を試みた。Mms13にコヘシンを、蛍光タンパク質にドックリンを融合し、まずは磁性細菌細胞内におけるドッキング（in vivoドッキングによる粒子上への蛍光タンパク質の固定化を行った。その結果、期待通り細胞内において蛍光タンパク質の固定化が観察された。ドックリン・コヘシンは種々のセルロース分解菌ごとに特異的な相互作用を示すことから、異なる菌由来のドックリン・コヘシンのペアを用いることで、複数種類の蛍光タンパク質を固定化することにも成功した。今後、ドックリン・コヘシンの相互作用をin vitroドッキングにおいても利用可能であるか、更なる検証を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度までに、当初想定していたZZドメイン・Fc部位の相互作用、およびドックリン・コヘシンの相互作用を利用した、磁性細菌粒子上における組み換えタンパク質のドッキングに成功した。これらの成果により、本研究の基盤技術である磁性細菌粒子上でのタンパク質ドッキング法が確立できたと考える。そのため来年度に予定されている、膜タンパク質への応用を滞りなく開始することが可能となった。以上の事より、本研究はおおむね順調に進んでいると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度中に基盤構築したドッキング技術を利用して、磁性細菌粒子上への膜タンパク質のドッキングを試みる。ドッキングタンパク質としてはZZドメイン・Fc部位を利用するが、適宜、ドックリン・コヘシンの利用も検討する。膜タンパク質の発現にあたっては、発現制御システムによる発現量の最適化を検討する。その事前実験として平成26年度に確立した単鎖抗体のドッキングシステムを用いて発現制御方法の詳細な検討を行う。また、膜タンパク質に種々の可溶化タンパク質を融合することで可溶性を図る。また、タンパク質のフォールディングを補助する分子シャペロンの共発現についても検討し、膜タンパク質の発現方法の最適化を推進する予定である。
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