2017 Fiscal Year Annual Research Report
ナイロン加水分解酵素の分子設計と産業応用への基盤研究
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26289317
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
根来 誠司 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (90156159)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武尾 正弘 兵庫県立大学, 工学研究科, 准教授 (40236443)
加藤 太一郎 鹿児島大学, 理工学域理学系, 助教 (60423901)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ナイロン分解酵素 / 再資源化 / タンパク質工学 / 耐熱性酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ナイロン加水分解酵素はポリアミドPA6、PA66、PA4 をエンド型で加水分解する酵素であり、前駆体として発現後、自己分断されて活性型酵素となる。親型酵素、および、種々の変異型酵素のＸ線結晶構造解析から、本酵素は同一モノマー４分子が会合したドーナツ型構造を有すること、サブユニット界面の変異により、会合状態、および、熱安定性が変化することを明らかにした。一方、溶液中の構造については、超遠心分析から、熱安定性が低い親型酵素（Tm=52℃）では、精製直後は、ダイマー・トリマー間の平衡状態（状態１）をとるが、モノマー・ダイマーの平衡状態（状態２）に移行することが明らかになった。さらに、NylCがエステル分解活性を保有しているという結果を見いだした。さらに、状態2では、ナイロン分解活性は状態1の約1/300に低下するが、エステル分解活性は、状態2においても、1/15程度に止まり、サブユニット解離が進行後も、比較的高い酵素活性を保持していることが分かった。さらに、変異導入により、熱安定性が40℃以上変化する、可溶画分に前駆体として存在する、凝集する、可溶画分にフラグメントのみが存在するなどの影響を受けることも見いだした。計算科学の面から、凝集、細胞内分解を誘起する構造的要因について検討するため、結晶構造を初期座標とし、欠落部位と水分子を補完し、平衡化構造の取得後、着目変異を導入し、シミュレーション中の各モノマーの構造変化を解析した。各モノマーについて、コンタクトマップを元に、比較したい2種類のモノマーの構造間で距離の値を差し引きして作られる行列 Difference Distance Map (DDM)による分析を行ったところ、耐熱性の高い変異体ほど、A/Dサブユニットが近接する関係が認められること、凝集する変異体では、不規則な相互関係が起きることを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NylC親型、変異型酵素を精製し、熱安定性の低い酵素はでは、保存中に会合状態や熱安定性が変化すること、保存後の状態２酵素においても、CD波長スペクトルは、状態１酵素と類似しており、二次構造に顕著な変化は認められなかったが、ナイロン分解とエステル分解の活性比が変動し、ポリマー分解には、３量体以上の分子会合が重要であるという新たな知見を得ることができた。さらに、結晶構造を初期座標とし、分子動力学シミュレーションにより、熱安定性の分子機構、酵素の凝集等の原因解明のための方法論を確立できたことから、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、ナイロンと同オリゴマーを加水分解する酵素(NylABC)、モノマー代謝に関与する酵素NylD (6-aminohexanoate aminotransferase)とNylE（adipate semialdehyde dehydrogenase）について、本基盤研究（B）以外に、挑戦的萌芽研究「代謝工学による６ナイロンモノマーの微生物生産」（平成28～30年度）（代表：根来誠司）を実施しているが、何れも、平成30年度が最終年度である。そこで、今後、これらを統合し、ナイロン分解酵素群の分子設計・代謝工学を進展させる必要性があると考えている。
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