Molecular design of nylon hydrolase and industrial application of the enzyme

2018 Fiscal Year Final Research Report

• Project/Area Number: 26289317
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Partial Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Biofunction/Bioprocess
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: Negoro Seiji 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (90156159)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武尾 正弘 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (40236443) ; 加藤 太一郎 鹿児島大学, 理工学域理学系, 助教 (60423901)
• Research Collaborator: HIGUCHI yoshiki ; SHIBATA naoki ; SHIGETA yasuteru ; GOTO yuji ; NAGAI keisuke ; TAKEHARA ikki
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ナイロン分解酵素 / アミド合成 / タンパク質工学

Outline of Final Research Achievements

Amide/ester compounds have been synthesized by using the reverse reaction of hydrolases by limiting water content in the reaction mixtures. In thermodynamically controlled synthesis, the final yields are essentially determined by the water content within the solvent environment. The yields of amide-synthesis obtained by reverse reaction using 6-aminohexanoate-dimer hydrolase in 90% t-butyl alcohol were drastically varied following several amino acid substitutions located at the entrance of the catalytic cleft of the enzyme. A movement of a loop region and a flip-flop of Tyr170 in the enzyme generate the local hydrophobic environment at the catalytic center. Here, we propose that the shift of the internal equilibrium between enzyme/substrate complex and enzyme/product complex by the “water-excluding effect” alters the rate of the forward/reverse reactions, and that the local hydrophobic environment potentially provides a reaction center suitable for efficient amide synthesis.

Free Research Field

タンパク質工学

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

加水分解酵素の逆反応によるアミド・エステル合成では、合成収率は基本的には、化学平衡で決定される。NylBでは、水分含量の高い条件、90％　t-ブタノール / 10%水系で、高収率でアミド合成反応を触媒する。同条件では、有機溶媒と水が溶解した１相系であり、基質・生成物とも溶解しているが、アミド合成の収率は80％以上に達する。これに対し、高い加水分解機能を有するにもかかわらず、合成反応が殆ど進行しない変異体を取得した（1％以下）。さらに、両変異体では、アミド合成・分解の触媒機能に大きな差異がある。このように、触媒中心近傍の構造と反応方向性を変化させることが可能であるという結果を得ることができた。