2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26289318
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
木野 邦器 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (60318764)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / 遺伝子 / 酵素 / 生体分子 / 生物・生体工学 / ペプチド / アミド化合物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ペプチド合成酵素の酵素学的知見と産業利用を促進するために、タンパク質立体構造情報およびアミノ酸配列情報から活性領域と推察される部位への変異導入とその評価によって、構造と機能の関わりを考察した。具体的な有用ジペプチドの効率的合成法の開発に成功するなど、その戦略の有用性を実証した。
今年度も呈味性ジペプチドのスクリーニングを継続し、新規な塩味増強ジペプチドとしてPro-Glyを見出した。合成収量向上を目的に前年度に得たMet-Glyでの知見を基にPseudomonas属由来のLalであるTabSへの部位特異的変異導入による改変を行ったところ、2種類の改変型酵素で野生型酵素よりもPro-Glyの合成量が増加し、それらを掛け合わせた二重変異型酵素では野生型TabS対比で1.6倍の収量向上を達成した。
また、β-AlaをN末端基質として認識するYwfEに対しても、同様の戦略に基づく機能改変を行い、抗酸化活性を有するカルノシン(β-Ala-L-His)の合成収量の大幅向上に成功した。
Lalを用いるペプチド合成も非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)由来のAドメインを用いた多様なアミド化合物の合成も、反応には当モルのATPが必要である。工業的プロセスを想定し、安価なポリリン酸を利用するポリリン酸キナーゼによるATP再生系の共役を検討した。ADPからATPへの再生が必要なLalの反応では問題のない結果を得た。一方、AMPからのATP再生を必要とするアミド化合物合成では、単一酵素でAMP→ADP→ATPを可能とする新規ポリリン酸キナーゼ(class III PPK2)に着目し、期待通りの効果を確認した。
結晶構造解析では、ポリ-α-グルタミン酸合成活性を有するRimKにおいて新規形状結晶の取得に成功し、分解能2.34Åで立体構造が決定され、基質の有無による構造上の変化を観察することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
ペプチド合成酵素に関するこれまでに得られた立体構造情報や機能と構造に関する知見を踏まえて酵素の機能改変を行い、機能性ジペプチドの二種類に対して、実現性の高い効率的合成法の開発に成功した。取得済のアミノ酸リガーゼ(Lal)を用いて構築したジペプチドライブラリーから、塩味増強ジペプチドとして新たにPro-Glyを発見した。しかも、Pro-Glyの選択的合成を可能とするTabSに対して計画的な変異導入を行い、野生型対比で1.6倍の収量向上を達成した。塩味増強ジペプチドに関するこれら一連の成果は、専門誌の記事や科学系新聞の一面にも取り上げられた。さらに、同様な酵素改変戦略によって、抗酸化作用を有する健康食品素材として広く販売されているカルノシン(β-Ala-L-His)の効率的生産を可能とするLalの取得にも成功した。YwfEに対し二重変異を導入した結果、約5倍に収量が向上した。変異酵素の速度論的解析によってもこの成果を裏付けた。
また、Lalによるペプチド合成やNRPS由来のAドメインを用いるアミド合成のようにATPを必要とする反応プロセスは、ATP供給が実用化における課題となる。菌体反応による生体内のATP再生システムの利用も考えられるが、ペプチドやアミド化合物は菌由来のペプチダーゼやプロテアーゼによって分解されてしまう。また、ADPからのATP再生は実績があるが、NRPS由来のAドメインを用いる反応のようにAMPからのATP再生はこれまでに報告がない。そこで単一酵素でAMP→ADP→ATPを可能とする新規ポリリン酸キナーゼ(class III PPK2)に着目して検討を行ったところ、その有効性が確認できた。本プロセスは、ADPをはじめAMPからのATP再生も可能とする適用範囲の広い技術であり、その有用性や独自性が評価され日本生物工学会の年次大会でもトピックスとして選定された。
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| Strategy for Future Research Activity |
新規形状結晶の取得と分解能2.34Åで立体構造が決定されたRimKに対し、その反応機構解明につながる基質との複合体の結晶構造情報取得を目指し、機能改変酵素のデザインを行う。また、カルノシン合成活性が著しく向上した変異型YwfEの結晶構造を明らかにし、野生型との比較解析を実施する。さらにオリゴペプチド合成可能なLalの結晶構造情報から鎖長制御の機構解明を目指す。
一方、変異型YwfEの結晶構造情報も踏まえて、カルノシン合成収量（変換効率）の向上を可能とする酵素のデザインを行い、新たな改変型酵素を取得する。得られた改変酵素の速度論的考察も加え、酵素特性の妥当性を検証する。さらに反応条件の最適化やポリリン酸キナーゼを組み込んだADPからのATP再生システムの有効性を評価し、実用的な機能性ジペプチドの生産プロセスを開発する。
NRPS由来のAドメインを用いる多様なアミド化合物の合成においては、AMPからATPを再生する新規ポリリン酸キナーゼを利用したプロセスを検討し、酵素反応ならびに菌体反応における課題抽出と有用性を明らかにする。ここで、今年度その有効性が示されたclass III PPK2に分類される新規ポリリン酸キナーゼを酵素化学的特性の面から解析を行い、classⅠ型やclassⅡ型ポリリン酸キナーゼとの違いなども明確にする。さらには、ペプチド性抗生物質であるTyrocidineの合成に関わるNRPS由来のAドメイン(TycA_A)を用いることでこれまで困難であったアミノアシルプロリン(Xaa-Pro)の酵素合成が可能となったが、具体的には血圧降下作用を有するXaa-Proの菌体反応による効率的な生産プロセスの開発を検討する。ここで、プロリン分解系の欠損性(PutA欠)やProlidase(PepQ)欠失変異の有効性を検証し、発酵法によるXaa-Pro生産の可能性を探る。
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| Remarks |
2015年度日本生物工学会大会で発表した「単一酵素によるAMPからのATP再生系の構築とアミノアシルプロリン合成への利用」は、トピックスとして選定された。
塩味増強ジペプチドに関する2015年度の日本農芸化学会ならびに日本生物工学会での発表が、JBAの「バイオサイエンスとバイオインダストリー」で注目発表として学会見聞記に掲載された。また、化学工業日報（2015.8.4）朝刊の一面に記事が掲載された。
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[Patent(Industrial Property Rights)] 塩味増強剤2015
Inventor(s)
木野はるか, 角谷政尚, 服部宏一, 木野邦器
Industrial Property Rights Holder
木野はるか, 角谷政尚, 服部宏一, 木野邦器
Industrial Property Rights Type
特許
Industrial Property Number
特願2015-128323
Filing Date
2015-06-26
