2014 Fiscal Year Annual Research Report
Shootinによる脳の形成とその機能不全による破綻の解明
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26290007
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
稲垣 直之 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (20223216)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Shootin / 大脳皮質形成 / ノックアウトマウス / ゼブラフィッシュ / メカノバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、脳組織形成を細胞が発生する力を基盤として解明することを目指す。組織形成のための細胞の移動や配置換えを担う仕組み、特にそのために力を発生させる分子機構は未だ不明である。そこで、Shootin1ノックアウトマウスを用いて前脳形成におけるShootinの役割を解明する。また、前脳にGFPを発現するゼブラフィッシュのライブイメージングにより、Shootinによる前脳形成機構を力の発生と細胞移動・配置換えの観点から明らかにする。さらに、ヒトの前脳形成におけるShootinの関与とその機能破綻が前脳形成障害を引き起こす可能性を調べる。
Shootin1にはスプライシングバリアントShootin1aとShootin1bが存在し、Shootin1のノックアウトマウスでは両方の分子がノックアウトされる。そこで、前脳組織形成にこれらの分子がどの様に関与するかを明らかとするため、まず、in situ hybridization と免疫染色法を用いて前脳の形成時期におけるShootin1aとShootin1bの脳内分布を詳細に解析した。また、ShootinのノックアウトマウスではShootin1の発現部位に一致した前脳の組織形成異常が認められた。次に、RT-PCRおよびin situ hybridizationによるゼブラフィッシュにおける遺伝子発現解析を行った。その結果、shootin1がゼブラフィッシュ脳に発現をすることが明らかとなった。また、脳以外の細胞でもshootin1の発現を確認し、発生時期におけるShootinの分布を詳細に解析した。
さらに、Shootinがヒトの前脳形成障害の原因遺伝子である可能性を調べるために、前脳形成障害患者のDNAサンプルを用いて、Shootin遺伝子配列の変異を解析した。これまでに５例の症例のShootin遺伝子配列解析が終了している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現時点までに、マウスやゼブラフィッシュにおけるShootin1aとShootin1b発現領域が明らかとなり、ShootinのノックアウトマウスでShootin1の発現部位に一致した前脳の組織形成異常が確認できたため。また、ヒトの前脳形成障害患者のShootin遺伝子配列解析も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ゼブラフィッシュにおけるShootinの脳内分布の解析（続き）：前年度の解析に加えて、Shootinの発現を生体内で生きたまま可視化するために、Shootinのプロモータの下流に転写因子Gal4を持つTol2コンストラクト(shootin:Gal4)を作成する。このTol2ベクターを転移酵素mRNAと共に受精卵に微量注入する。微量注入した胚を成魚にまで育て、UAS:GFP系統と掛け合わせることにより、Shootinの発現を視覚化できる魚を単離する。この魚を用いたタイムラプスライブイメージングで、脳の発生に伴うShootin発現のダイナミクスを詳細に調べる。
２）ゼブラフィッシュにおけるShootin の機能解析：ゼブラフィッシュにおけるShootinの機能解析のために、TALEN法を用いてShootinの変異体を作成する。作成したShootinの変異体の表現型を、前述の脳あるいは前脳特異的にGFPを発現するトランスジェニック系統との交配を行って詳細に解析する。さらにShootinの変異が確かに異常表現型の原因であることを確認するために、異常表現型の回復実験を行う。ShootinのmRNAをShootin変異体の受精卵に微量注入し、異常表現型が回復するか否かを調べる。以上の、モルフォリノヌクレオチド、変異体、表現型の回復による一連の解析を通じて、ゼブラフィッシュ脳組織発生におけるShootinの役割を解明する。
３）ヒト前脳形成障害のShootin1遺伝子の解析（続き）：前年度に引き続き、ヒト前脳形成障害患者のDNAサンプルを用いて、Shootin遺伝子配列解析を推進する。
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| Causes of Carryover |
今年度、予想通りの研究成果を挙げたが、予定していた物品費の一部が不要だったため次年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究の成果を更に高めるため、物品の購入に充てるとともに、予定している論文の投稿および、印刷費に充てる。
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