Ｄ１/Ｄ２ドーパミン受容体コンディショナル発現マウスによる運動制御機構の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26290029
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 笹岡 俊邦 新潟大学, 脳研究所, 教授 (50222005)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤澤 信義 新潟大学, 脳研究所, 助教 (50199311) ; 佐藤 俊哉 北里大学, 医学部, 教授 (90359703) ; 小田 佳奈子 新潟大学, 脳研究所, 特任助教 (60708212) ; 大久保 直 北里大学, 医学部, 准教授 (10450719) ; 佐藤 朝子 北里大学, 医学部, 臨時職員(研究職) (10465932)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: パーキンソン病モデル動物 / ドーパミン受容体 / 遺伝子改変マウス / 時期特異的ノックダウン / 発達期 / 生殖工学的技術 / ニホンザル / 運動機能調節

Outline of Annual Research Achievements

パーキンソン病(PD)は高齢者の重要疾患であり、病因の解明、新規治療法や予防法の開発が急務である。PDの運動障害等の症状は黒質-線条体のドーパミン(DA)神経の変性脱落が主な原因である。本研究では、DA情報伝達の主要経路である大脳基底核のD1ドーパミン受容体(D1R)を介する「直接路」及びD2ドーパミン受容体(D2R)を介する「間接路」に着目し、コンディショナル遺伝子操作法によりD1R 及びD2R の発現を調節し、それぞれ「直接路」と「間接路」の情報伝達を変化させてPDの運動障害の解明に相応しいモデルマウスを開発する。当該マウスを用いてDAによる運動調節機能を解明し、PDの症状の理解を深め、新規治療法・予防法の開発への貢献を目指す。
遺伝背景をそろえたD1Rノックアウト(KO),D2RKO マウスを用いて,自発活動量・ローターロッド・ステップホイールの行動解析を用いて、D1RKO,D2RKO の明確な表現型の違いを論文に報告した。
D1RKOマウスと成熟期にD1Rを欠損したマウスを比べると運動量変化が正反対であったため、D1Rが生後発達期において時期特異的に欠損した場合の脳に及ぼす影響を形態学的・生化学的・行動学的に解析するため、生直後にD1R発現抑制が可能な実験条件を確立した。
マウスによる研究成果について霊長類を用いて検証する準備として、ニホンザルの動作や神経活動のモニターを可能とする実験ブースの仕様を検討し、サル飼育・実験エリア内に導入した。
発生・生殖工学技術を用い, D1R, D2RKOマウス等の遺伝子改変マウスを供給しているが,この技術を用いて生まれたマウスは, 体重増加傾向にあることを見いだした。生殖工学的操作で必須である体外培養が初期胚の発生および個体発生に影響を及ぼすかを検討し、これまでに体外培養胚ではインプリント遺伝子に発現変化があることを見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

疾患モデル動物の行動変化の評価について、標的遺伝子の遺伝子操作マウスは有用な情報を与えるが,しばしば,異なる研究室からの解析結果が一致しないことが課題となっている。その原因はモデル動物の遺伝背景の違い,あるいは実験方法の違いによることも考えられる。例えば運動量評価には,同一遺伝背景で,同一実験方法がであることが望ましい。これまでにドーパミン受容体のコンジェニック系統の遺伝子変異マウスを用いて,ホームケージにおける運動量・摂食量・飲水量による評価方法を開発した。遺伝背景をそろえたコンジェニック系統を用いて,同一の条件下で解析する実験システムを採用した。ホームケージにおける自発運動量の評価のため,連続する５日間にわたり,外的要因で運動量が変化することを少なくできる環境下での動物の活動量を自発運動量として測定した。さらに活動性の特徴をより良く理解する為,単位時間当りの運動量により運動の強さを解析すること,及び一区切りの運動の運動開始から停止までの平均継続時間と,5日間の観察期間中に活動状態を示す回数を解析し、運動の変化を明確にできる方法を確立した。
通常のD1Rノックアウトマウスと成熟期のD1Rコンディショナルノックアウトマウスでは、運動量の変化に対照的な結果が見出されたため、発達初期におけるD1Rの機能解析が必要となった。そこでD1Rノックダウンの条件を確定させて,発達初期からD1Rを欠くD1R ノックアウトマウスとの比較検討を今後進めることができるようになった。
シールドルーム内の実験環境にニホンザルを順化させるための訓練方法やビデオカメラ、モニター等の測定機器のシステム構築の検討が可能となった。
体外培養を行なった胚のインプリント遺伝子に発現変化があることが見出され、体外培養が初期胚の発生および個体発生に影響を及ぼす仕組みを解明する可能性について手がかりを得た。

Strategy for Future Research Activity

これまでに、D1R欠損マウスを用いて自発運動量の定量を行なうと、運動量が野生型マウスよりも上昇していたが、Tet-offシステムによりD1R発現を制御する遺伝子を、D1R欠損の遺伝背景に導入したマウス(D1Rノックダウンマウス)を作成し、成熟期にドキシサイクリン(DOX)投与によりD1R発現を抑制すると、D1R欠損マウスとは異なり、自発運動量が低下していた。これはD1R欠損マウスは発達初期よりD1R欠損の状態であり、D1Rノックダウンマウスは、成熟期にD1Rを欠損させることから、「直接路」による運動量の調節には、発達段階を考慮して詳細な研究が必要であることを示している。そこでD1R ノックダウンマウスを用いて（１）自発運動量、摂食量・飲水量の計測,（２）運動機能評価のための行動実験,（３）導入遺伝子の発現様式の解析,（４）「直接路」「間接路」の主要分子の生化学法・組織化学法による解析,（５）黒質-線条体ドーパミン神経の組織学的解析,（６）線条体神経細胞の電気生理学的解析,（７）D1R及びD2Rの作動薬/拮抗薬を用いた薬理学的解析を進め、成果を取り纏める。また、D2Rの機能を解明する為、前記の（８）Tet-OFFシステムを用いたD2R 発現マウスの作成を進め、DOXによるD2R発現のOn/Offの制御を解析する。D2Rの発現制御が確認された後には、上記と同様に（１）から（７）の解析を開始する。
研究用ニホンザルの入手手続きを進めるとともに先行研究に関する情報収集に努め、パーキンソン病の霊長類モデル動物作成方法および運動異常の解析・評価方法の開発をめざす。
体外培養が初期胚の発生および個体発生に及ぼす影響について、遺伝子発現様式の網羅的解析をDNA マイクロアレイで行うことにより体外培養で特異的に変化している遺伝子パターンを明確にし、その仕組みを明らかする。

Causes of Carryover

物品購入等の納品検収は平成26年度内に完了したが、支払いが４月となり次年度となったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

物品購入等の納品検収は当該年度に完了し、４月に支払いが完了している。

Research Products

• [Journal Article] 統合失調症モデルマウスの行動解析方法の試み (2015)
  • Author(s): 笹岡俊邦,佐藤朝子,中村徹,大久保直,佐藤俊哉,藤澤信義,前田宜俊,小田佳奈子,酒井清子,神保幸弘,馬川恵梨子,木津川尚史,籾山俊彦,山森哲雄
  • Journal Title: 日本生物学的精神医学会誌 Volume: 26 Pages: 87-94
  • Open Access
• [Journal Article] G-CSF supports long-term muscle regeneration in mouse models of muscular dystrophy (2015)
  • Author(s): Hayashiji N, Yuasa S, Miyagoe-Suzuki Y, Hara M, Ito N, Hashimoto H, Kusumoto D, Seki T, Tohyama S, Kodaira M, Kunitomi A, Kashimura S, Takei M, Saito Y, Okata S, Egashira T, Endo J, Sasaoka T, Takeda S and Fukuda K
  • Journal Title: Nat Commun. Volume: 6 Pages: 6745
  • DOI: doi: 10.1038/ncomms7745
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Distinct motor impairments of dopamine D1 and D2 receptor knockout mice revealed by three types of motor behavior. (2014)
  • Author(s): Nakamura T, Sato A, Kitsukawa T, Momiyama T, Yamamori T, Sasaoka T.
  • Journal Title: Front Integr Neurosci. Volume: 8 Pages: 56
  • DOI: doi: 10.3389/fnint.2014.00056.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Enhanced stability of hippocampal place representation caused by reduced magnesium block of NMDA receptors in the dentate gyrus. (2014)
  • Author(s): Hayashi Y, Nabeshima Y, Kobayashi K, Miyakawa T, Tanda K, Takao K, Suzuki H, Esumi E, Noguchi S, Matsuda Y, Sasaoka T, Noda T, Miyazaki JI, Mishina M, Funabiki K, Nabeshima YI
  • Journal Title: Mol Brain Volume: 7 Pages: 44
  • DOI: doi: 10.1186/1756-6606-7-44.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Lack of dopaminergic inputs elongates the primary cilia of striatal neurons. (2014)
  • Author(s): Miyoshi K, Kasahara K, Murakami S, Takeshima M, Kumamoto N, Sato A, Miyazaki I, Matsuzaki S, Sasaoka T, Katayama T, Asanuma M.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 9 Pages: e97918
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0097918.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] GABAergic synaptic transmission onto striatal cholinergic interneurons in dopamine D2 receptor knock-out mice. (2014)
  • Author(s): Sato A, Sasaoka T, Nishijo T, Momiyama T.
  • Journal Title: Neuroscience. Volume: 263 Pages: 138-147
  • DOI: doi: 10.1016/j.neuroscience.2014.01.010.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Effect of in vitro culture of an early embryo on development of a mouse. (2015)
  • Author(s): Kanako Oda, Toshiya Sato,Yoshitaka Maeda, Seiko Sakai, Yukihiro Jimbo Nobuyoshi Fujisawa, Minesuke Yokoyama, Toshikuni Sasaoka.
  • Organizer: 第5回新潟大学脳研究所共同研究拠点国際シンポジウム,BRI International Symposium,2015.
  • Place of Presentation: 新潟大学脳研究所（新潟県・新潟市）
  • Year and Date: 2015-03-05 – 2015-03-06
• [Presentation] D1ドーパミン受容体欠損マウス及びD2ドーパミン受容体欠損マウスは3つの行動解析法において異なる運動異常を示す (2015)
  • Author(s): 笹岡俊邦
  • Organizer: 第4回生理学研究所-脳研究所合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 新潟大学脳研究所（新潟県・新潟市）
  • Year and Date: 2015-03-04 – 2015-03-05
• [Presentation] 人工ヌクレアーゼ技術による内在性TDP-43遺伝子改変と筋萎縮性側索硬化症モデルへの応用 (2014)
  • Author(s): 佐藤俊哉，小田佳奈子，酒井清子，西澤正豊，小野寺理，横山峯介，笹岡俊邦
  • Organizer: 第44回新潟神経学夏期セミナー
  • Place of Presentation: 新潟大学脳研究所（新潟県・新潟市）
  • Year and Date: 2014-08-01 – 2014-08-01
• [Presentation] 初期胚の体外培養がマウスの個体発生に及ぼす影響. (2014)
  • Author(s): 小田佳奈子,佐藤俊哉,前田宜俊,酒井清子,藤澤信義,横山峯介,笹岡俊邦
  • Organizer: 第44回新潟神経学夏期セミナー
  • Place of Presentation: 新潟大学脳研究所（新潟県・新潟市）
  • Year and Date: 2014-08-01 – 2014-08-01
• [Presentation] 人工ヌクレアーゼ技術による内在性TDP-43遺伝子改変と筋萎縮性側索硬化症モデルへの応用 (2014)
  • Author(s): 佐藤俊哉，小田佳奈子，酒井清子，西澤正豊，小野寺理，横山峯介，笹岡俊邦
  • Organizer: 第55回新潟生化学懇話会
  • Place of Presentation: 長岡技術科学大学 （新潟県・長岡市）
  • Year and Date: 2014-06-28 – 2014-06-28
• [Presentation] Ｄ１ドーパミン受容体の発現抑制によりマウスの自発運動量が低下する (2014)
  • Author(s): 笹岡俊邦、佐藤朝子、新井慧、前島純、大久保直、藤澤信義、佐藤俊哉、小田佳奈子、前田宜俊、田中稔、山本美丘、酒井清子、神保幸弘、千葉さおり、横山峯介
  • Organizer: 第61回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 北海道 札幌市
  • Year and Date: 2014-05-15 – 2014-05-17
• [Presentation] 初期胚の体外培養がマウスの個体発生に及ぼす影響. (2014)
  • Author(s): 小田佳奈子,佐藤俊哉,前田宜俊,酒井清子,藤澤信義,横山峯介,笹岡俊邦.
  • Organizer: 第61回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 北海道 札幌市
  • Year and Date: 2014-05-15 – 2014-05-17
• [Presentation] 新潟大学脳研究所動物実験施設の改修工事 － その3 施設運用開始と問題点 － (2014)
  • Author(s): 前田宜俊,小田佳奈子,酒井清子,永田史也,神保幸弘,田中稔,山本美丘,千葉さおり,佐藤俊哉,藤澤信義,横山峯介,笹岡俊邦
  • Organizer: 第61回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 北海道 札幌市
  • Year and Date: 2014-05-15 – 2014-05-17