2014 Fiscal Year Annual Research Report
Genomic/non-genomic手法の統合による代謝関連遺伝子機能の解明
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26290067
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| Research Institution | Research Institute, International Medical Center of Japan |
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Principal Investigator |
加藤 規弘 独立行政法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 部長 (80293934)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
並河 徹 島根大学, 医学部, 教授 (50180534)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム / マイクロアレイ / 遺伝子 / エピゲノム / mRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノムワイド関連解析などの探索的ゲノム解析により見いだされてきた遺伝子座／染色体領域の、責任遺伝子の同定の可否〔Genomic approach〕、および遺伝子発現変化等の機序の解明〔Non-genomic approach〕について、両アプローチを組み合わせた、代謝関連疾患の統合的理解を研究目的とする。大きく以下の３つの課題に取り組む。
課題1. 代謝関連疾患形質の責任遺伝子座におけるexpression-QTL (eQTL：QTLは量的形質遺伝子座の略称)の探究：インスリン抵抗性のモデルである高血圧自然発症ラット （SHR）系統と対照のWistar Kyotoラット（WKY）系統間で、主要な遺伝的効果を示す、代謝関連疾患形質の責任遺伝子座（positional QTL：pQTLと略）の近傍領域に関して、（1）SNPの系統分布様式、（2）遺伝子発現量の系統差、を調べる。
課題2. エピゲノム（DNAメチル化）の検討：ゲノムワイドなDNA methylation arrayを用いて、腎臓、肝臓、脂肪の組織間でのDNAメチル化の違いを検討する。その際、（1）「geneticとepigenetic variantsが親から子の世代に一緒に受け継がれるかどうか」を組織別に調べる。（2）代謝関連疾患に関わる介入（食塩負荷、高脂肪食負荷、及び糖質コルチコイド負荷）に伴う、遺伝-環境相互作用としてのepigeneticsの意義を検討する。
課題3. microRNA (miRNA)の変動と分子ネットワークの探究：ゲノムワイドなRat miRNA microarrayを用いて、DNAメチル化解析と同様、組織間での発現プロフィールの違いを検討する。その際、miRNA（とその標的配列）の多型が代謝関連疾患形質のpQTL本体であるかどうか、および遺伝-環境相互作用におけるmiRNAの意義を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究実績の概要」で述べた通り、本研究では大きく３つの課題に取り組んでいる。
課題1〔代謝関連疾患形質の責任遺伝子座におけるeQTLの探究〕に関しては、SHRとWKY間の実験的交配系（F2世代等）で同定した血圧、血糖、血中脂質（総コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸）、体重、相対心重量などのpQTLをリスト化し、その近傍領域に関して、（1）SNPの系統分布様式（公的データベースおよび全ゲノムシーケンスデータに基づく）と（2）遺伝子発現量の系統差（心臓と腎臓のmicroarrayデータに基づく）を調べた。これらの結果を統合することで、両系統間のeQTLの絞り込みを行った。さらに、pQTLが集積するラット染色体１番に関して作成した、一連のコンジェニック系統を用いて、pQTLとeQTLの異同を調べた結果、特定の遺伝子座／染色体領域においては、一つでなく複数のeQTLが存在し得ることが実証された。しかしながら、発現変動に影響するような塩基配列バリエーションを同定するのは相当困難であること、およびcis-eQTLとtrans-eQTLの２種類が存在して「バリエーション→標的（発現変動）遺伝子」のループは二重三重に絡み合う可能性があることも分かった。
課題2〔DNAメチル化の検討〕と課題3〔miRNAの変動と分子ネットワークの探究〕については、解析すべき組織検体（progenitor系統の通常餌飼育下と介入に伴う、腎臓、肝臓、脂肪のDNA・miRNA）を準備し、各々のmicroarray本実験にとりかかる前の予備的検討（検体の品質評価、miRNA濃度の検定など）を行った。特に血漿中からのmiRNA抽出には、試薬の鮮度を含めて相当繊細な実験手順を要することが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続いて、主に課題２と課題３の部分を実施する。
課題2〔DNAメチル化の検討〕では、12週齢のSHR系統とWKY系統（N=5ずつ）から摘出した組織を用いて、MeDIP (methylated DNA immunoprecipitation)で高品質なDNAを抽出する。このDNAを、Rat DNA methylation arrayにhybridizationしてDNA methylationの系統差を調べる。ラット染色体1番、3番、4番に関しては、複数の主要なpQTLが同定され、詳細にコンジェニック系統が作成されているため（1番が18系統、3番が8系統、4番が7系統）当該領域のコンジェニック系統でも遺伝子発現量を適宜調べて、trans eQTLの影響の有無を確認する。SHR系統で、食事（食塩および高脂肪食）介入を12週齢から16週齢までの4週間、薬物（糖質コルチコイド）介入を12週齢からの3日間行い、介入前後でのDNA methylationと遺伝子発現の変化をゲノムワイドに調べる。
課題3〔miRNAの変動と分子ネットワークの探究〕では、DNAメチル化の解析と同様、15K Rat miRNA Microarray (Agilent社製)を用いて、miRNA発現プロフィールの系統差、主要なpQTL及びeQTLとの重なりの有無、介入に伴う変化を調べる。組織間での発現プロフィールの違いを検討すべく、腎臓、肝臓、脂肪を解析対象とする。
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| Causes of Carryover |
課題2〔DNAメチル化の検討〕と課題3〔miRNAの変動と分子ネットワークの探究〕に用いるmicroarrayの購入が次年度に繰り越されたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成26年度に、解析すべき組織検体（progenitor系統の通常餌飼育下と介入に伴う、腎臓、肝臓、脂肪のDNA・miRNA）を準備し、各々のmicroarray本実験にとりかかる前の予備的検討（検体の品質評価、miRNA濃度の検定など）を行ったため、平成27年度にはmicroarrayの本実験を実施する。
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