非コードRNAによる細胞内構造構築機序の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26291001
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 廣瀬 哲郎 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (30273220)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ノンコーディングRNA / 核内構造体 / タンパク質凝集

Outline of Annual Research Achievements

核内構造体パラスペックルの構造構築には、NEAT1 long noncoding RNA (lncRNA)に依存したタンパク質の会合プロセスが必須である。今年度は構造構築におけるタンパク質機能に焦点をあわせ、これまで実施者が明らかにしてきた必須RNA結合タンパク質の相互作用様式の解析及び新規会合因子であるクロマチンリモデリング複合体の解析を併せて実施した。まずこれまでNEAT1 lncRNAの蓄積に影響を与えずにパラスペックル構造の会合を担っているカテゴリー1B タンパク質として分類されているFUS, DAZAP1, HNRNPH3が共通して保有するプリオン様ドメインを重要性を検討した結果、これらのドメインがパラスペックル形成に需要な役割を果たしているプレリミナリーデータを得た。一方で新たなパラスペックル構造の会合因子として同定したSWI/SNFクロマチンリモデリング複合体の機能解析を進めた結果、この複合体がクロマチンがほとんど含まないパラスペックル内部においてパラスペックル構成タンパク質同士の相互作用ネットワークの形成に重要な役割を果たしていることを見出だした。特にSWI/SNF複合体サブユニットは、NEAT1 lncRNAと直接相互作用する一方で、カテゴリー1と呼ばれる必須タンパク質とNEAT1に依存せずに相互作用していることも明らかになった。このことは、SWI/SNF複合体がパラスペックル内相互作用形成を促進しているだけでなく、そこに関わる必須因子をNEAT1近傍にリクルートするのに働いていると考えられる。この他にパラスペックルへのタンパク質着脱機構の解析のために、可逆的転写阻害剤を用いた新規パラスペックル合成系の至適化を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、1. パラスペックル形成に必須なカテゴリー1Bタンパク質の作用機構の解析、2. 新たなパラスペックル会合因子であるSWI/SNF複合体の作用機構の解析、3. パラスペックル内外へのタンパク質の脱着機構解析のための解析系の構築という３つの項目について研究を実施した。1については、このカテゴリーのタンパク質が共通して保有しているプリオン様ドメインの重要性を示唆するプレリミナリーデータを得ることでき、2についてはSWI/SNF複合体のパラスペックル内の微細局在解析及びパラスペックル因子間の相互作用解析を通して、クロマチンとは無関係なSWI/SNF複合体の新規な機能を明らかにすることができた。3については、パラスペックル構造をde novoに形成させるための過程をモニターするために可逆的転写阻害剤を利用した系を至適化することに成功した。以上の成果からほぼ計画通りに進行したと評価できる。

Strategy for Future Research Activity

本年度新たに得られた新知見をさらに発展させるために以下の研究内容を計画している。1. カテゴリー1Bタンパク質の欠損細胞へのレスキュー実験系を整備し、プリオン様ドメインの変異体を用いたレスキュー実験を実施しプリオン様ドメインの有用性を明らかにする。さらにこれを基にパラスペックル構造形成を支える分子間相互作用基盤を同定する。2. SWI/SNF複合体のクロマチンリモデリング活性が、パラスペックル形成に必須であるかどうかを明らかにするためにBRG1またはBRMサブユニットの触媒活性に必要なATPaseドメインに変異を施した変異型SWI/SNF複合体を有する細胞ラインを創出し、その細胞におけるパラスペックル形成をモニターする。3. de novoパラスペックル形成系におけるNEAT1の発現量と係留されるパラスペックルタンパク質の量を定量し、パラスペックルへのタンパク質着脱機構の基盤データとする。

Causes of Carryover

研究はおおむね予定通りに進んだが、パラスペックルタンパク質の機能ドメインのレスキュー実験に用いる変異体を作成する実験は、他の実験項目で新しい知見が得られたためにそちらで時間を要し、到達しなかった。この変異体作成には、人工遺伝子合成などを依頼する予定のため、その外注費が次年度使用額として生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度明らかにしたカテゴリー1パラスペックルタンパク質のプリオン様ドメインに複数の部位特異的な変異を導入した変異体を人工遺伝子合成によって作成し、本年度までに至適化した培養細胞におけるレスキュー系において機能相補実験を実施する。この結果を基に当初次年度計画していたプリオン様ドメインを介したパラスペックル構造形成を支える相互作用の同定解析に結びつけて行く予定である。

Research Products

• [Journal Article] SWI/SNF chromatin-remodeling complexes function in noncoding RNA-dependent assembly of nuclear bodies. (2015)
  • Author(s): Kawaguchi, T., Tanigawa, A., Naganuma, T., Ohkawa, Y., Souquere, S., Pierron, G., Hirose, T.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume: 112 Pages: in press
  • DOI: doi: 10.1073/pnas.1423819112
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The building process of the functional paraspeckle with long non-coding RNAs. (2015)
  • Author(s): Yamazaki, T., Hirose, T.
  • Journal Title: Front. Biosci. Volume: 7 Pages: 1-47
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Genome-wide co-localization screening of nuclear body components using a fluorescently tagged FLJ cDNA clone library. (2015)
  • Author(s): Hirose, T., Goshima, N.
  • Journal Title: Methods Mol. Biol. Volume: 1262 Pages: 155-163
  • DOI: doi: 10.1007/978-1-4939-2253-6_9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rapid and Efficient Elimination of Specific Nuclear Noncoding RNAs in Mammalian Cells with Antisense Oligonucleotides. (2015)
  • Author(s): Hirose, T., Mannen, T.
  • Journal Title: Methods Mol. Biol. Volume: 1206 Pages: 149-156
  • DOI: doi: 10.1007/978-1-4939-1369-5_13.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The lncRNA Neat1 is required for corpus luteum formation and the establishment of pregnancy in a subpopulation of mice. (2014)
  • Author(s): Nakagawa, S., Shimada, M., Yanaka, K., Mito, M., Arai, T., Takahashi, E., Fujita, Y., Fujimori, T., Standaert, L., Marine, J.C., Hirose, T.
  • Journal Title: Development Volume: 141 Pages: 4618-4627
  • DOI: doi: 10.1242/dev.110544.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The long noncoding RNA Neat1 is required for mammary gland development and lactation. (2014)
  • Author(s): Standaert, L., Adriaens, C., Radaelli, E., Van Keymeulen, A., Blanpain, C., Hirose, T., Nakagawa, S., Marine, J.C.
  • Journal Title: RNA Volume: 20 Pages: 1844-1849
  • DOI: doi: 10.1261/rna.047332.114
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The Estrogen receptor alpha regulated lncRNA NEAT1 is a critical modulator of prostate cancer. (2014)
  • Author(s): Chakravarty, D., Sboner, A., Nair, S., Giannopoulou, E., Li, R., Hennig, S., Mosquera, J.M., Pauwels, J., Park, K., Kossai, M., MacDonald, T., Fontugne, J., Erho, N., Vergara, I., Ghadessi, M., Davicioni, E., Jenkins, R., Palanisamy, N., Chen, Z., Nakagawa, S., Hirose, T., et al.
  • Journal Title: Nat. Commun. Volume: 5 Pages: 5383
  • DOI: doi: 10.1038/ncomms6383.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Elements and machinery of non-coding RNAs: toward their taxonomy. (2014)
  • Author(s): Hirose, T., Mishima, Y., Tomari, Y.
  • Journal Title: EMBO Rep. Volume: 15 Pages: 489-507
  • DOI: doi: 10.1002/embr.201338390.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] RNA機能と神経変性 (2015)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: 日本神経学会北海道支部
  • Place of Presentation: 北海道大学（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2015-03-08 – 2015-03-08
  • Invited
• [Presentation] Subnuclear architecture by long noncoding RNAs (2014)
  • Author(s): Tetsuro Hirose
  • Organizer: 理研セミナー
  • Place of Presentation: 理化学研究所横浜キャンパス（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2014-12-08 – 2014-12-08
  • Invited
• [Presentation] Search for RNA-dependent subnuclear structures in mammalian cells (2014)
  • Author(s): Tetsuro Hirose
  • Organizer: Tokyo RNA Club
  • Place of Presentation: 東京大学（東京都・文京区）
  • Year and Date: 2014-11-28 – 2014-11-28
  • Invited
• [Presentation] The possible common mechanism underlying assembly of the nuclear bodies on architectural long noncoding RNAs (2014)
  • Author(s): Tetsuro Hirose
  • Organizer: Japan-Australia joint meeting
  • Place of Presentation: シドニー（オーストラリア）
  • Year and Date: 2014-11-02 – 2014-11-05
  • Invited
• [Presentation] The common mechanism underlying assembly of the nuclear granules on the architectural noncoding RNAs (2014)
  • Author(s): Tetsuro Hirose
  • Organizer: EMBO-ESF conference
  • Place of Presentation: プルタスク（ポーランド）
  • Year and Date: 2014-10-14 – 2014-10-17
• [Presentation] ノンコーディングRNAネオタクソノミに向けた課題 (2014)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: RNAバイオインフォマティクス道場
  • Place of Presentation: 産業技術総合研究所北海道センター（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2014-08-26 – 2014-08-28
  • Invited
• [Presentation] PAR-CLIP法を用いた核内RNA顆粒の構造構築RNAの探索 (2014)
  • Author(s): 萬年 太郎、五島 直樹、油谷 浩幸、塩見 春彦、廣瀬 哲郎
  • Organizer: 日本RNA学会年会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知県・名古屋市）
  • Year and Date: 2014-07-23 – 2014-07-25
• [Presentation] 難溶性RNAの解析：NEAT1 ncRNAの細胞内再定量と新しいRNA群の探索 (2014)
  • Author(s): 中條 岳志、廣瀬 哲郎
  • Organizer: 日本RNA学会年会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知県・名古屋市）
  • Year and Date: 2014-07-23 – 2014-07-25
• [Presentation] クロマチン再構築複合体はncRNAに依存した複数の核内RNA構造体形成に必要である (2014)
  • Author(s): 川口 哲哉、谷川 明恵、長沼 孝雄、木村 宏、大川 恭行、Sylvie Souquere、Gerard Pierron、廣瀬 哲郎
  • Organizer: 日本RNA学会年会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知県・名古屋市）
  • Year and Date: 2014-07-23 – 2014-07-25
• [Presentation] Architectural noncoding RNAによる細胞内構造構築 の分子機構とその意義 (2014)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: 日本生化学会北海道支部会
  • Place of Presentation: 北海道大学（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2014-07-18 – 2014-07-18
  • Invited
• [Presentation] Architectural noncoding RNAs controlling subnuclear organization and gene expression (2014)
  • Author(s): Tetsuro Hirose
  • Organizer: 第９回附置研究所ネットワーク国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 大阪大学（大阪府・吹田市）
  • Year and Date: 2014-06-19 – 2014-06-21
• [Presentation] ノンコーディングRNAによる核内構造体形成機構 (2014)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: 日本細胞生物学会シンポジウム
  • Place of Presentation: 奈良県新公会堂（奈良県・奈良市）
  • Year and Date: 2014-06-10 – 2014-06-12
  • Invited