2014 Fiscal Year Annual Research Report
複製開始領域および新規な制御因子DARSとdatAにおける複合体の時空間動態制御
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26291004
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
片山 勉 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (70264059)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 義人 九州大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (60315091)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / ゲノム / 細菌 / 蛋白質 / 分子機械 / 高次複合体 / DNA複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸菌染色体の複製起点oriC上ではDnaA蛋白質の多量体が形成される。次いで、２重鎖DNAの開裂（局所的な１本鎖化）からDnaBヘリカーゼの結合・１本鎖DNA上への装着まで多様な反応段階で、DnaA多量体が重要な役割を果たす。本研究では、まず、DnaA多量体に含まれる個々のDnaA分子を特異的に解析するため、大腸菌DnaAのDNA結合ドメインを、大腸菌DnaA box（DnaA結合部位）配列と異なる配列に特異的に結合する高度好熱菌DnaAホモログのそれに置換した。作成されたキメラDnaAは大腸菌DnaA boxには結合せず、高度好熱菌DnaA boxには結合した。キメラDnaAの変異体、および、複製起点oriC内のDnaA boxを高度好熱菌DnaA boxに個々に置換した変異oriCを組み合わせ、in vitro, in vivo両面から、複合体の形成と機能を詳しく解析した。これらの結果に基づき、開始複合体形成における新たな分子原理を明らかにし、新たな複合体構造動態モデルを提案した（論文投稿中）。
また複製開始に重要な役割を持つDnaBヘリカーゼの残基を新たに見出し、in vitro, in vivo両面から解析を進めた。さらに、出芽酵母の開始複合体ORCの解析のため、効率の良い新たな大量生産・精製系を開発した。
DnaA制御機構の解明のため、制御因子であるHdaの変異体の解析を進めた。またヒストン様因子IHFが、DnaA活性を制御する非コードDNA因子datAおよびDARS2に細胞周期中、適時的に結合して、それらの活性を制御することを見出している（PNAS, 2013 ; NAR, 2014）。そのためDARS2-IHF複合体の解離機構を解析するため、粗蛋白質抽出液を検討し、DARS2-IHF複合体の解離を特異的に促進する画分を検出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画については、ほとんど達成しているのみならず、キメラDnaAおよび出芽酵母ORCの解析では次年度の計画内容の一部を既に進行させている。ただDARS2-IHF複合体の解離活性の精製については、アッセイ系において困難な部分に直面し時間がかかった。総合しておおむね計画どおり進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
全体的には順調に進行しているので、今後も計画に従って進展させる。DARS2-IHF複合体の解離活性の精製についてはアッセイ系を改善したので、慎重に検討しながら、精製を進めてゆく。
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| Causes of Carryover |
DARS2-IHF複合体を解離する粗蛋白質画分の活性を検出する段階まで進んだが、その後、精製を進めようとするとヌクレアーゼ等の妨害因子の共存が問題となってきた。そのため、活性のアッセイ法を再検討するなどして時間がかかり、目的の因子の精製があまり進まなかった。よって精製のために必要な費用の使用が遅れた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記の問題のため再検討した結果、現在は新たなアッセイ法を構築しており、計画どおり精製を進行させることができる。よって、27年度はこの実験の遂行のため使用する予定である
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