転写共役ヌクレオチド除去修復開始反応のin vitro再構成

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26291005
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 荻 朋男 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (80508317)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 真下 知士 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80397554)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: DNA修復 / 転写と共役したヌクレオチド除去修復

Outline of Annual Research Achievements

UV照射後のPol II のユビキチン化を詳細に解析するためユビキチン化経路に関わるいくつかの阻害因子で細胞を処理したところ、幾つかの阻害剤によりGG-NERは正常だったがTC-NERが減弱した。またsiRNAによるノックダウンの解析では、ある種のE3リガーゼ複合体がPol IIのユビキチン化に関わることが判明した。
UVSSAはpolIIのユビキチン化に関与していると考えられ、幾つかのドメインの変異体を作成し、解析をおこなっている。Pol IIはUVSSA非存在化では迅速に分解されるが、幾つかの変異体ではC32R変異体と同様にPol IIの分解速度の回復はできなかった。
一方、UVSSAの機能解明の糸口として、UVSSAタンパク質の結晶構造解析に挑んでいる。UVSSAは非常に不溶性であるため精製が困難であったが、これまでに本研究においてUVSSAの精製に必要な幾つかの条件を決定した。現在、結晶化に向けた全長UVSSAの精製を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

UVSSAがPol IIの分解サイクルに重要であるという新たな証拠を同定した。
UVSSAタンパク質は本研究を開始した時点では精製すること自体が困難であったが、現在時点では結晶構造解析に向けて大量精製出来る段階にまで進展している。

Strategy for Future Research Activity

UVSSA依存的に起こるUV照射後のPol IIのユビキチン化サイトをLC/MS/MSを用いて直接同定する。ユビキチン化Pol IIの量が少ないため修飾部位の同定が難しいが、サンプル調整方法を改良して行う。
また、UVSSAをノックアウトしたHCT116細胞からユビキチン化ペプチドを単離・濃縮して行うSILAC解析（ユビキトーム解析）により、Pol IIのユビキチン化におけるUVSSAの作用機序を明らかにしていく。

Causes of Carryover

本年度は、結晶構造解析と生化学実験の改良を行ったが、共同研究等を活用し、予定していたより安価に実施できた事から、事前に予定していた研究費を次年度に繰り越し、さらなる条件検討を実施するための消耗品費として使用する事とした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

UVSSAによるRNA polⅡoのユビキチン化反応の調査を引き続き実施するための消耗品費として使用する。また、結晶構造解析に特化した精製条件を使用して、標的蛋白質を大量精製する。結晶構造解析のためのスクリーニングを実施するための、消耗品費用に充当する予定である。

Research Products

• [Journal Article] A ten-year follow up of a child with mild case of xeroderma pigmentosum complementation group D diagnosed by whole genome sequencing. (2016)
  • Author(s): Ono R, Masaki T, Mayca Pozo F, Nakazawa Y, Swagemakers SM, Nakano E, Sakai W, Takeuchi S, Kanda F, Ogi T, van der Spek PJ, Sugasawa K, Nishigori .
  • Journal Title: Photodermatol Photoimmunol Photomed Volume: 32 Pages: 174-180
  • DOI: 10.1111/phpp.12240.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] XRCC4 deficiency in human subjects causes a marked neurological phenotype but no overt immunodeficiency. (2015)
  • Author(s): Guo C*, Nakazawa Y*（equal contribution）, Woodbine L*, Bjorkman A, Shimada M, Fawcett H, Jia N, Ohyama K, Li TS, Nagayama Y, Mitsutake N, Pan-Hammarstrom Q, Gennery AR, Lehmann AR, Jeggo PA, Ogi T.
  • Journal Title: Journal of Allergy and Clinical Immunology Volume: 136 Pages: 1007-1017
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2015.06.007.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] SETDB1, HP1 and SUV39 promote repositioning of 53BP1 to extend resection during homologous recombination in G2 cells. (2015)
  • Author(s): Alagoz M, Katsuki Y, Ogiwara H, Ogi T, Shibata A, Kakarougkas A, Jeggo P§.
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 43 Pages: 7931-7944
  • DOI: 10.1093/nar/gkv722.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Novel compound heterozygous DNA ligase IV mutations in an adolescent with a slowly- progressing radiosensitive-severe combined immunodeficiency. (2015)
  • Author(s): Tamura S, Higuchi K, Tamaki M, Inoue C, Awazawa R, Mitsuki N, Nakazawa Y, Mishima H, Takahashi K, Kondo O, Imai K, Morio T, Ohara O, Ogi T, Furukawa F, Inoue M, Yoshiura K, Kanazawa N.
  • Journal Title: Journal of Clinical Immunology Volume: 160 Pages: 255-260
  • DOI: 10.1016/j.clim.2015.07.004.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 「紫外線から遺伝子を守る」紫外線DNA損傷を修復する分子メカニズムとその破綻により発症する疾患の病態解明 (2016)
  • Author(s): 荻 朋男
  • Organizer: 太陽紫外線防御研究委員会第26回シンポジウム
  • Place of Presentation: グランフロント大阪（大阪府大阪市）
  • Year and Date: 2016-03-04 – 2016-03-04
  • Invited
• [Presentation] ゲノム不安定性を示す難治性遺伝性疾患群の症例収集とゲノム・分子機能解析による病態解明研究 (2015)
  • Author(s): 中沢 由華、荻 朋男、唐田 清伸、郭 朝万、岡 泰由、 賈 楠、嶋田 繭子、宮崎 仁美、千住 千佳子
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-02 – 2015-12-02
• [Presentation] XRCC4 deficiency in human subjects causes a marked neurological phenotype but no overt immunodeficiency (2015)
  • Author(s): 郭 朝万、中沢 由華、嶋田 繭子、賈 楠、唐田 清伸、 岡 泰由、宮崎 仁美、千住 千佳子、荻 朋男
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-02 – 2015-12-02
• [Presentation] 各種コケイン症候群の分子診断 (2015)
  • Author(s): 賈 楠、中沢 由華、荻 朋男、唐田 清伸、郭 朝万、岡 泰由、 嶋田 繭子、 宮崎 仁美、 千住 千佳子
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-02 – 2015-12-02
• [Presentation] XRCC4deficiencyinhumansubjectscausesamarkedneurologicalphenotypebut no overt immunodeficiency (2015)
  • Author(s): 郭 朝万、中沢 由華、嶋田 繭子、賈 楠、唐田 清伸、岡 泰由、宮崎 仁美、千住 千佳子、荻 朋男
  • Organizer: 第23回DNA複製・組換え・修復ワークショップ
  • Place of Presentation: 焼津グランドホテル（静岡県焼津市）
  • Year and Date: 2015-10-20 – 2015-10-20
• [Presentation] ゲノム不安定性を示す難治性遺伝性疾患群の症例収集とゲノム・分子機能解析による病態解明研究 (2015)
  • Author(s): 中沢 由華、荻 朋男、郭 朝万、唐田 清伸、岡 泰由、賈 楠、嶋田 繭子、宮崎 仁美、千住 千佳子
  • Organizer: 第23回DNA複製・組換え・修復ワークショップ
  • Place of Presentation: 焼津グランドホテル（静岡県焼津市）
  • Year and Date: 2015-10-20 – 2015-10-20
• [Presentation] 転写の異常により発症する疾患の診断法と分子病態 (2015)
  • Author(s): 荻 朋男
  • Organizer: 第67回日本皮膚科学会西部支部学術大会
  • Place of Presentation: 長崎ブリックホール（長崎県長崎市）
  • Year and Date: 2015-10-18 – 2015-10-18
  • Invited
• [Presentation] ヒトXRCC4遺伝子機能の欠損は神経変性と強い放射線感受性を示すが正常な免疫機能を保持する (2015)
  • Author(s): 荻 朋男
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ゲノム不安定性疾患の症例収集と新規DNA修復遺伝子の同定 (2015)
  • Author(s): 荻 朋男
  • Organizer: 遺伝研研究集会
  • Place of Presentation: 国立遺伝学研究所（静岡県三島市）
  • Year and Date: 2015-10-01 – 2015-10-02
  • Invited