2015 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
26291010
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
西増 弘志 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (00467044)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 結晶構造 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細菌Staphylococcus aureusに由来する小型のCas9（SaCas9）、sgRNA、（5’-TTGAAT-3’ PAM、5’-TTGGGT-3’ PAM）を含む標的DNAからなる複合体の結晶構造を決定し、SaCas9-sgRNAによるDNA認識機構を解明した。構造情報をもとにSaCas9を改変し、新規の転写活性化ツールおよび誘導型ヌクレアーゼを作製した。細菌Francisella novicidaに由来する大型のCas9（FnCas9）の構造機能研究を行った。機能解析の結果、FnCas9は5’-NGG-3’という塩基配列をPAMとして認識することが明らかになった。FnCas9、sgRNA、（5’-TGG-3’ PAM、5’-TGA-3’ PAM）を含む標的DNAからなる複合体の結晶構造を決定し、FnCas9-sgRNAによるDNA認識機構を解明した。構造情報をもとに5’-YG-3’ PAMを認識するFnCas9改変体を作製した。FnCas9-sgRNA RNPをマウス受精卵に注入することにより5’-YG-3’ PAMをもつ標的配列のゲノム編集に成功した。3種類のSpCas9改変体の結晶構造を決定し、それらのPAM認識機構を解明した。野生型SpCas9との比較から、アミノ酸置換により標的2本鎖DNAの構造変化が引き起こされPAM認識が改変されていることが明らかになった。SpCas9、SaCas9、FnCas9の構造を比較することにより、CRISPR-Cas9系における保存性および多様性が明らかになった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
SaCas9、FnCas9の結晶構造をCell誌に発表し、SpCas9改変体の結晶構造をMol Cell誌に発表したため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
piRNA経路の中核因子であるPIWIに関して結晶構造解析を進める。
|
| Causes of Carryover |
Cas9オルソログの結晶構造決定を目指したが、適切なタイミングで放射光施設ビームタイムを確保できなかったため、それらの実験をH28年度に延ばす必要があったため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費（タンパク質調製、結晶化試薬）として使用する。
|
-
-
[Journal Article] Structure and Engineering of Francisella novicida Cas92016
Author(s)
Hisato Hirano, Jonathan S. Gootenberg, Takuro Horii, Omar O. Abudayyeh, Mika Kimura, Takanori Nakane, Ryuichiro Ishitani, Izuho Hatada, Feng Zhang, Hiroshi Nishimasu, Osamu Nureki
-
Journal Title
Cell
Volume: 164
Pages: 950-961
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
-
-
-
-
-
-
