2014 Fiscal Year Annual Research Report
細胞外O-GlcNAc修飾のNotchシグナルと血管形成における役割
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26291020
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
岡島 徹也 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20420383)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹下 享典 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (70444403)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Notch / EOGT / O-GlcNAc |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、数年前に新規翻訳後修飾として細胞外O-GlcNAc 修飾の存在を発見し、EOGTを介した新規のO-GlcNAc修飾機構を解明した (Nature Commun. 2011; BBRC 2012)。一方で、哺乳動物では、EOGTはNotch受容体を糖修飾するが、生理機能は不明であった。最近、EOGTの遺伝子変異が、四肢末端と頭頂部に異常を伴う病因不明のAdams-Oliver症候群において同定された。本研究では、ヒトの表現型を手がかりにして、EOGT欠損マウスを用いた網膜血管の表現型解析や遺伝学的相互作用解析、そして、レポーターアッセイや相互作用解析などにより、細胞外O-GlcNAc修飾のNotchシグナルと血管形成における生物学的機能を解明することを目的とした。
本年度は、網膜血管におけるEOGTの発現と血管形成における機能解析を進めた。網膜において、in situ hybridizationによりEOGTの発現様式を検討したところ、Isolectin B4染色と共局在するシグナルが検出されたことより、EOGTは血管内皮に発現することが明らかになった。EOGTを欠損した成体マウスの各臓器には、形態学的に明らかな異常は観察されないものの、Sulfo-NHS-LC-Biotinを用いた灌流実験より、EOGT欠損マウスの血液網膜関門が正常に保たれていないことが明らかになった。さらに、Tie2-Creマウスと掛け合わせて、血管内皮特異的なEOGT欠損マウスを作成したところ、EOGTホモマウスと同様な血液網膜関門の異常が観察された。これらの結果より、細胞外O-GlcNAc修飾が血液網膜関門において、血管のintegrityの保持に必要であることが、明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
EOGTの血液網膜関門における役割を明らかにしたこと、血管内皮における役割を示唆するデータを得たこと、などの研究成果をもとに、次年度以降の研究の進展が大いに期待できるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. EOGT欠損マウスにおけるNotchシグナル関連分子の発現
網膜血管において、PericyteにおけるNotch3や、血管内皮におけるJagged1, Dll4、Notch1が、Notchシグナルを介した正常な血管形成に重要な役割を果たすと報告されている [J Boucher et al. Frontiers in physiology, 2012]。また逆に、これらの分子は、Notchシグナルによって発現レベルが制御される。そこで、EOGTのNotchシグナル制御への関与を解析にするために、EOGT変異体におけるNotch3、Jagged1, Dll4の遺伝子発現の変化を網膜のwhole mount stainingにより明らかにする。また、活性化型Notch1抗体［V1744］により、Notchシグナルの活性化レベルをin situにて解析する。
2. O-GlcNAcによるNotchシグナル制御の分子機構
Notchリガンドの細胞外ドメインには、EGFリピートが存在しており、受容体同様にO-GlcNAc修飾される可能性がある。従って、細胞外O-GlcNAcのNotchシグナル調節の様式として、①リガンドのシグナルを送る能力②Notch受容体のシグナルを受け取る能力を制御する、という２通りの分子機序が想定できる。以下の方法に従い、これらの可能性を検証する。1. EOGT欠損培養細胞を用いたNotchシグナルのレポーター解析。2. EOGT欠損培養細胞を用いたNotch受容体やリガンドの細胞表面における発現レベルのFACS解析。3. EOGT欠損培養細胞に用いたNotch受容体とリガンド間の結合能の解析。
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[Journal Article] O-fucose monosaccharide of Drosophila Notch has a temperature-sensitive function and cooperates with O-glucose glycan in Notch transport and Notch signaling activation.2015
Author(s)
Ishio A, Sasamura T, Ayukawa T, Kuroda J, Ishikawa HO, Aoyama N, Matsumoto K, Gushiken T, Okajima T, Yamakawa T, Matsuno K.
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Journal Title
J Biol Chem
Volume: 290
Pages: 505-519
DOI
Peer Reviewed
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