2014 Fiscal Year Annual Research Report
すべての生物に共通する膜タンパク質形成過程の構造生命科学
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26291023
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
塚崎 智也 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (80436716)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | YidC / Sec / 膜タンパク質 / 組込み / 蛋白質輸送 / SecYEG / Ｘ線結晶構造解析 / 構造生命科学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体膜には、生命活動に不可欠な多くの膜タンパク質が埋め込まれ機能している。YidCは、細菌からミトコンドリアまで広く保存された膜タンパク質で、新規に合成されるタンパク質の膜組み込みに関与する。YidCは2つの機能を持つ。YidCはタンパク質の膜組み込みを行うほか、膜タンパク質の正しいフォールディングを促進するシャペロンとして働く。その基質として呼吸鎖複合体のサブユニットなどが含まれているため、細菌の生育に必須である。しかしながら、YidCの膜貫通領域を含んだ構造情報は得られておらず、YidCがどのように基質と相互作用し膜へと組み込むのかなど、その分子機構は明らかとなっていない。我々は、Bacillus halodurans 由来のYidCと大腸菌由来YidCの結晶構造をそれぞれ2.4、3.2 オングストローム分解能で決定した。YidCは新規フォールドを持つ5回膜貫通型タンパク質であり、膜貫通ヘリックスの内側に、多くの親水的なアミノ酸残基を含んだ親水的な溝を持っていた。この溝は、細胞内側と膜側に開いている一方で、細胞外側には閉じていた。構造情報に基づいた枯草菌を用いた遺伝学的な解析と光クロスリンク実験の結果、基質はYidCの親水的な溝と相互作用すること、溝の内側に存在する保存されたArgがYidCの機能に重要であることが明らかとなった。これらの知見から、YidCが親水的な溝によって疎水的な膜内に親水的な環境を形成し、基質の細胞外領域と膜内で相互作用することで基質を膜内に引き込み、タンパク質膜組み込みを達成するという分子機構を提唱した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り,YidCの構造の報告を行った。研究計画にそって順調に進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度構造を決定したYidCの構造情報に基づく機能解析と，YidCを含む複合体の構造解析を進める。
YidCの機能解析：YidCによる膜組込みや膜シャペロンとして機能する分子メカニズムの解明を目指し，YidC単独の構造情報を基盤とした機能解析を開始させる。申請者らは同一生物種T.t. のSecY複合体, SecA, SecDFの構造を決定し，機能解析の系を組んでいる。T.t. YidCの精巧なホモロジーモデルを作製し，機能解析へと進める。構造情報は機能解析が進んでいる大腸菌のYidCや枯草菌YidCの解析にも適用させる。構造に基づき種々の変異体を作製し，遺伝学的・生化学的解析ならびに分子動力学的解析を進め，YidCが介助するタンパク質膜組み込み機構を解明する。YidCは他のSecタンパク質などと複合体を形成するが，その詳細な相互作用とメカニズムについては不明であるため，Secタンパク質との複合体の構造情報が必要である。
YidCとSecタンパク質複合体の精製，結晶化：YidCは，SecYEGやSecDFと相互作用していることが示されている(Nouwen and Driessen et al., 2002; Sachelaru et al., JBC 2013)。YidCの分子メカニズムの完全理解の為には，これら巨大な複合体の解析が欠かせない。大腸菌 SecYEG, SecDF, YidC は同時に過剰発現させることができ(Bieniossek et al., Nat. Methods 2009)，大腸菌 SecYEG-SecDF-YidC 複合体は,適切な界面活性剤を選択すれば単離できる(Duong & Wickner,1997,EMBOJ.)。同様の手法によりT.t. 由来YidCと，Secタンパク質を同時に大腸菌に過剰発現させ，精製する系を組む。様々な界面活性剤を検討し，安定に複合体を精製できる条件を探索する。状況に応じて，それぞれの構造情報と生化学的なデータに基づき，ジスルフィド結合などによる架橋によって複合体を安定化させ結晶化する手法(Inaba et al., Cell 2006; Saitoh et ai., EMBO J 2007)も用いる。安定に複合体を単離できれば，結晶構造解析を進める。
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| Causes of Carryover |
２７３円のみ次年度とした。大きな変更はなく，おおむね予定通り進行している。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
２７３円のみ次年度とした。大きな変更はなく，おおむね予定通り進行している。
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[Journal Article] Structural basis for Sec-independent membrane protein insertion by YidC2014
Author(s)
Kaoru Kumazaki, Shinobu Chiba, Mizuki Takemoto, Arata Furukawa, Ken-ichi Nishiyama, Yasunori Sugano, Takaharu Mori, Naoshi Dohmae, Kunio Hirata, Yoshiko Nakada-Nakura, Andres D. Maturana, Yoshiki Tanaka, Hiroyuki Mori, Yuji Sugita, Fumio Arisaka, Koreaki Ito, Ryuichiro Ishitani, Tomoya Tsukazaki and Osamu Nureki
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Journal Title
Nature
Volume: 509
Pages: 516-520
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of YidC, a membrane-protein chaperone and insertase from Bacillus halodurans2014
Author(s)
Kaoru Kumazaki, Tomoya Tsukazaki, Tomohiro Nishizawa, Yoshiki Tanaka, Hideaki E. Kato, Yoshiko Nakada-Nakura, Kunio Hirata, Yoshihiro Mori, Hiroaki Suga, Naoshi Dohmae, Ryuichiro Ishitani and Osamu Nureki
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Journal Title
Acta Crystallographica Section F
Volume: 70
Pages: 1056-1060
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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