2015 Fiscal Year Annual Research Report
PCNAサイクルと連動したタンパク質分解による複製制御
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26291025
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
西谷 秀男 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (40253455)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
塩見 泰史 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (80380567)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 核酸 / 複製 / タンパク質 / 分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞増殖において、次世代の細胞へ遺伝情報を正しく継承するため、染色体の複製は細胞周期に一度だけ正確に行なわれるように制御されている。CRL4-Cdt2 によるユビキチン化を介した分解系は、クロマチン上に装着（ロード）されたPCNA に依存して、複製開始に必須なライセンス化因子Cdt1 をはじめとする特定の因子をS期に（およびDNA損傷後においても）迅速に選別的に分解する。その機構を分子レベルで解明するため研究を行った。
1. 精製タンパク質を用いたin vitroでの解析.
ニックが１カ所入った環状DNAを結合したビーズに、精製したPCNAおよびローダータンパク質RFC1-RFCを用いて、このDNA上にPCNAをロードする系を確立したので、Cdt1およびCRL4-Cdt2の結合について検討した。両者ともDNAのみとも弱い結合が見られたが、PCNAがロードされていると，さらに結合量が増加した。CRL4-Cdt2は，PCNAに結合したCdt1を捉えてDNA上に結合してくると予想されたが、Cdt1なしでもPCNAに結合することが分かった。この結合には、in vivo の解析から得られていたようにCdt2のPIP―ボックスが直接重要な働きをすることが分かってきた。
2. Cdt2のドメイン解析＿C末側の機能解析
酵母Cdt2と比較するとヒトCdt2は長いC末領域を持ち、そのC末端にPIPボックス配列がある。Cdt2(PIP)変異を発現する安定発現株を作成した。CRL4-Cdt2(PIP)が核内PCNA部位へのリクルートが低下することを確かめた。さらに内在性Cdt2をノックダウンして、CRL4-Cdt2(PIP)のCdt1ポリユビキチン化活性を調べると低下しており、N末だけを持つCdt2と比較しても、かなり低下することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
精製タンパク質を用いたin vitro の解析により、CRL4-Cdt2は、基質なしでもDNAにロードされたPCNAに結合するという予期していなかった結果を得た。そして、基質認識に関わると予想されるWT40リピートを含むN末だけでは、ユビキチン化能力を発揮出来ないことから、C末、特にPIPボックスのユビキチン化促進における重要性をより明確に証明できつつある。また、C末側に存在するプロテインキナーゼCDKのリン酸化配列をアラニンに変異したCdt2を作成し，安定発現株を作成したところ，S期およびM期で見られるCdt2のリン酸化がほぼ起こらなくなることを見いだしている。その他、ライブイメージングを行なうための蛍光タンパク質融合PCNAプラスミドの発現も見ており、次年度の研究を進める準備も行なっている。よって、研究は、おおむね順調ん進行していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. Cdt2は、Cdt1の分解を行なうS期から高度にリン酸化される。リン酸化がCRL4-Cdt2のユビキチン化活性を制御していると予想される。C末に存在するプロテインキナーゼCDK予想リン酸化部位のセリン／スレオニンをアラニンに置換した変異Cdt2を安定に発現する細胞株を用いて、Cdt1の分解が阻害されるか、促進するか検討する。また，この変異がUV照射後のCdt2のリン酸化レベルに与える効果も調べ、Cdt1の分解，特にM期におけるCdt1の分解の様子を調べる。さらに，C末端の部分欠失変異体、アラニン置換体を作成し、重要な機能ドメインがないかどうか明らかにする。
2. in vitro 系を用いて、DNA上へのCdt1およびCRL4-Cdt2の集積、PIPボックス依存性について、さらに詳細な解析を進める。現在まだ、Cdt1のin vitroユビキチン化が完成していないので、E2のコンビネーションや核抽出液を加えるなどを検討し、系の開発を進める。
3. 蛍光タンパク質融合PCNAを安定に発現する株を作成し、別の蛍光タンパク質で標識したCdt1あるいはCdt2を共発現して、シングルセルライブイメージングで、S期開始後の分解の様子を時空間的に解析する。
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| Causes of Carryover |
大学からの講座費で購入した試薬等を当該研究にも利用でき、また、本学生命理学研究科にて共有の共焦点顕微鏡が新規に設置され，申請時に予定していた物品の購入が不要になったため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度の研究費と合わせて、研究の遂行に必要な物品の購入にあて、適正に使用する。
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