2014 Fiscal Year Annual Research Report
非興奮性細胞の電位作動性カルシウムチャネルのサブユニット間相互作用の領域と役割
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26291026
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| Research Institution | Tokyo Gakugei University |
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Principal Investigator |
飯田 秀利 東京学芸大学, 教育学部, 教授 (70124435)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 電位作動性カルシウムチャネル / サブユニット / 出芽酵母 / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母のCch1は、ほ乳類の電位作動性カルシウムチャネルのα1サブユニットのホモログである。Cch1がカルシウムチャネルとしてはたらくためには、サブユニットであるMid1の存在が不可欠である。本研究では、Mid1に依存しない変異型Cch1の取得と解析を目的とした。その取得に当って、細胞外に出ているCch1のシステイン残基（Cys）に着目した。Cch1には細胞外に出ていると予想されるCys残基が１０個ある。本研究によりそのうちの２残基がMid1との相互作用に必要であることが示唆された。一方、Mid1に着目すると、細胞外に出ていると予想されるCys-rich領域には１０個のCys残基が存在する。今年度の研究の結果、そのうちの２残基がCch1との相互作用に関与する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cch1分子とMid1分子上の互いに相互作用する可能性の高い部位を特定できたため。これにより、今後両分子間の相互作用の実像を明らかにできれば、Mid1がなくても活性をもつCch1分子をデザインできると予想される。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度にCch1分子上でCys残基がタンパク質間相互作用をしている可能性が示唆されたので、このCys残基がジスルフィド結合をしているか否かを調べる。同様にMid1分子上のCys残基がジスルフィド結合をしているか否かを調べる。また、Cch1の細胞外ループにランダムに変異を導入して、Mid1に非依存的にはたらける変異型Cch1をスクリーニングする。
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| Causes of Carryover |
平成26年度において、計画していたMid1に非依存的にCa2+を取込める変異型Cch1のスクリーニングを行ったが、目的のものは単離することができなかった。この原因として、Cch1が2,039アミノ酸残基から成るという非常に大きな分子であるために、Cch1にランダムに変異を入れる方法では、変異箇所に偏りが出た可能性が考えられた。そこで、同年度中に研究戦略を変え、Cch1分子上でMid1と相互作用をする可能性のある領域を特定することに切り替えた。そして、その特定に成功した。このような背景から、変異型Cch1の塩基配列決定に使用する費用を次年度に繰り越すこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度特定に成功した、Cch1分子上でMid1と相互作用をする可能性のある領域にMn-PCR法、および大腸菌XL1-Red株利用法を用いて、ランダムに突然変異を入れる。その領域を、Cch1全長になるようにCch1の他の領域と融合させ、mid1 cch1二重欠損株に導入し、mid1非依存的にCa2+を取込める株を多数分離する。分離した株からプラスミドDNAを取り出し、塩基配列を決定する。次年度使用額は、このような一連の研究に使用する。
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Research Products
(8 results)
