2014 Fiscal Year Annual Research Report
原子分解能で細胞を解析する部位選択高感度固体核磁気共鳴法
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26291029
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤原 敏道 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20242381)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞内分子構造 / 核磁気共鳴 / 生物物理学 / 常磁性造影剤 / 細胞内局在イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内において運動性の高い球状蛋白質などの機能，構造，相互作用，安定性を原子分解能で解析できるのがIn-cell NMR分光法である。本課題では，この方法を発展させて運動性の低い生体膜の蛋白質構造や細胞質の蛋白質集合体構造を定量的高感度でNMR解析可能にする。同時にNMRで細胞内での位置情報を得られるようにする。応用としてモデル膜蛋白質pHTrIIについてNMRで得られた蛋白質構造や細胞内位置情報，電子顕微鏡像を組み合わせて，0.1nmから1μmの分解能で細胞モデル構造を提示する。このために，1) 多次元固体NMR定量測定法，2)NMR感度を1000倍向上させたDNP固体NMR法，3)位置情報を与える常磁性造影剤・分極剤の細胞局在法，4)スピン拡散距離測定法，5)対象蛋白質選択的な安定同位体13C,15N標識法を実施する。初めに上記の要素技術を高度化する。例えば，2)では感度向上DNP用分極剤の細胞内局在の実証，4)では細胞表面に局在する造影剤との距離を求めるための磁気緩和速度解析を行う。これらを標識蛋白質が含む細胞系に適用可能にして統合する。各要素技術は既に部分的に開発を進めている。これらを統合して，膜蛋白質pHtrIIと水溶性蛋白質ユビキチンについて，細胞内での蛋白質構造など状態，蛋白質数，細胞内での存在分布を明らかにする。これに基づいて，対象蛋白質にフォーカスした細胞モデル構造を最終年度に提示する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NMR定量法：1細胞当たりについて，標識蛋白質数，共鳴周波数で区別できる他の蛋白質，核酸，糖，脂質を定量できるようにした。ここではNMRのシグナル面積強度は，試料内の核スピン数に比例することを利用した。定量性を損なう分子運動に依存した信号強度変調を除去し，実験中の溶菌を防ぐために，実験は250 K以下の低温で行った。装置に依存した感度の影響を除くために，内部基準を加える。細胞数については，透過型電子顕微鏡での細胞の形状測定，光学顕微鏡による細胞数計測も組み合わせることにより，NMRで求めることを試みた。
蛋白質立体構造解析：標識した蛋白質については，13C,15Nについて一連の多次元マジック角回転固体NMRスペクトルを測定して，残基分解能での高次構造を明らかにした。このスペクトル解析には，我々が開発したNMR蛋白質情報学に基づく自動構造解析法RESPLSを用いた。また，シグナルの線幅から構造の揺らぎ情報を得る。膜蛋白質pHtrIIとユビキチンについて，この解析を行った。
DNP-NMR感度向上法 ：In-cell 固体NMRスペクトルは，大量発現させた菌体であっても，通常固体NMRスペクトルに比べて約2割程度の感度になり，測定には数日の積算を要した。DNP法で500倍以上高感度化させることで，1時間以下での測定や発現量の低い蛋白質の解析が可能にな用に試みた。DNP実験では，ラジカル化合物テンポールなどを用いた。親水性の異なるラジカル化合物や基剤を試して，NMR感度が最大になるよう条件を最適化した。DNPによる感度向上を行うプロトタイプ装置は，1H共鳴周波数600MHzの磁場強度で完成させ，ジオルレゾナンス社と開発した磁場強度700MHzの装置を蛋白研に設置して，感度と分解能向上を計った。この装置についてマシンタイムの一部を本課題に供した。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞に局在する常磁性造影剤・分極剤利用法：常磁性造影剤は，これまで核磁化緩和促進度が最も大きいGd3+イオンを調べた。Gd3+については弱いながらも，大腸菌の内膜に対する透過性を示す結果を得ている。この解析では，細胞内の水の核磁化緩和速度から常磁性種濃度を見積もった。望ましい毒性の低いキレート錯体Gd3+-DOTAについても細胞での局在を調べて応用する。また，DNP用のラジカル分極剤についても，ニトロキシド・ラジカルのテンポール以外に寿命の長い炭素ラジカルX63も利用する。DNPで分極（超偏極）するのに要する時間に依存したNMRスペクトルを測定して細胞での局在性を評価する。この評価では，核分極の増大以外に「スピン拡散距離測定法」も用いる。
細胞内の特定蛋白質選択的な同位体標識法：細胞内で特定の蛋白質を同位体標識する。この方法は，単一蛋白質生産法（SPP法）およびIPTG誘導による大量発現法を用いる。SPP法では，RNA分解酵素も同時に発現させて，目的蛋白質以外のRNAを切断することで目的蛋白質のみを発現させる。すでに膜蛋白質pHtrIIと水溶性蛋白質ユビキチンについてはSPP法で試料調製できることを確認している。これは，児嶋長次郎准教授がラトガース大の井上正順研究室から蛋白質調製技術を習得し，最近，私たちの研究室でも可能になった。上記二つの標識方法で，対象蛋白質を標識して細胞内での蛋白質標識の選択性，蛋白質構造と細胞での局在を調べる。このSPP法は標識選択性が高く，代謝によるリークが少ないとする結果を得ている。なお，蛋白質構造が天然状態と同一であることが実証できれば，この方法で蛋白精製を行わずにNMRで容易に蛋白質を構造解析できるようになる。
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| Causes of Carryover |
実験に用いた固体NMR装置および固体DNP-NMR装置は，2014年度の1月に更新あるいは新規導入したものである。これらのJRI製のNMR装置は，生体系への応用が想定されていなかったため，プリアンプ部，RF位相サイクル，スピュリアス信号，極低温でのコンデンサー不良，断熱低温ガス制御など多くの点で，実用的な稼働まで約10ヶ月間，装置改良をメーカーと協力してメーカー負担で行った。このため，必ずしも十分な装置時間を確保できなかった。本課題実験は装置が利用できる範囲で稼働させて行った。このため試料調製やローターなどNMR備品に対する支出が計画より少なかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在，固体NMR装置は，装置更新以前の性能を出せるようになったので，当初計画に従って行い，試料調製用安定同位体やNMR測定備品などを購入して，実験的研究を進める予定である。
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[Journal Article] The crystal structure of the plant small GTPase OsRac1 reveals its mode of binding to NADPH oxidase2014
Author(s)
Ken-ichi Kosami, Izuru Ohki, Minoru Nagano, Kyoko Furuita, Toshihiko Sugiki, Yoji Kawano, Tsutomu Kawasaki, Toshimichi Fujiwara, Atsushi Nakagawa, Ko Shimamoto, and Chojiro Kojima
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 41
Pages: 28569-78
DOI
Peer Reviewed
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