2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26291030
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤原 祐一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20532980)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 生理学 / 膜電位 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心臓の拍動や脳の活動に代表されるように、細胞膜を介した電気的シグナリングは我々の生命活動にとって重要な役割を果たしています。その電気活動を発生させ制御する中心的な役割を担う分子が電位依存性イオンチャネルです。電位依存性イオンチャネルは分子内のプラスに帯電したアミノ酸残基をセンサーとして利用して、細胞膜にかかる電位（膜電位）を感じ取って構造変化を起こし、イオンの透過を制御しています。本研究では、最小単位の電位依存性チャネルであるH+チャネルを対象に、電気生理学的手法、光学的観測手法を用いて、分子の構造変化、センサー電荷の動きをダイナミックに解析し、電位依存性チャネルが膜電位を感じとるメカニズムを分子構造のレベルから明らかにすることを目的に行います。
本年度は、電位センサーの膜電位に応答した動きを観測し、膜電位を感知する動的構造基盤を明らかにする試みを行った。野生型Hvおよび変異体Hvに対して、電位センサーに点変異でCys残基を導入しローダミンを架橋付加しツメガエル卵母細胞に発現させ、二本刺し膜電位固定法による膜電位コントロール下に電位センサーの動きをローダミンから発せられる蛍光シグナルの変化により測定した。蛍光シグナルの発生域値や電流－電圧関係、膜電位依存性、キネティクスといった基本となるパラメターを定量的に解析し、電気生理学的パラメタと比較した。
Hvの結晶構造をもとに２量体モデルを作成し、分子動力学的解析を行った。２量体間機能連携の構造基盤を明らかにし、膜電位依存性との相関を考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、当初の予定通り、Hvの野生型および変異型チャネルに対して光科学的解析を行い、膜電位に応答して変化するシグナルを検出することが出来た。前年度に引き続き分子動力学的解析を行った。これら結果を踏まえ来年度以降の研究を遂行出来るため、研究課題はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、電気生理学的解析結果、光科学的解析結果と分子動力学的解析結果の相関を検討し、分子が膜電位を感じる仕組みを検討・考察する。他の電位依存性チャネルに適用するため、Hvチャネルと他の電位依存性チャネルとのキメラ体を作成し、解析を行い、膜電位感受性の普遍的な理解を目指す。
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| Causes of Carryover |
研究遂行上、近年報告されたHvチャネルの結晶構造をもとにした分子動力学的解析を優先して行った。分子動力学的解析は消耗品費をほとんど必要としないため、次年度使用額が生じた。そのため他の電位依存性チャネルとのキメラ体実験や、光学的実験と電気生理学的実験の同時測定実験などの実験にやむを得ない遅延が生じ、実験機器購入費・消耗品費などの物品費と人件費・謝金に次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試薬購入に1,600,000円、国内学会参加旅費に100,000円、海外学会参加旅費に300,000円、実験補助員の雇用に2,200,000円、その他印刷出版費に200,000円
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[Journal Article] Conductance of P2X4 purinergic receptor is determined by conformational equilibrium in the transmembrane region.2016
Author(s)
Minato Y, Suzuki S, Hara T, Kofuku Y, Kasuya G, Fujiwara Y, Igarashi S, Suzuki EI, Nureki O, Hattori M, Ueda T, Shimada I.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A.
Volume: 113
Pages: 4741-4746
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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