2014 Fiscal Year Annual Research Report
パターン化人工膜を用いた膜タンパク質のラフト親和性と機能の解析
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26291031
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
森垣 憲一 神戸大学, 遺伝子実験センター, 准教授 (10358179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 文夫 神戸大学, 理学(系)研究科(研究院), 名誉教授 (80093524)
鈴木 健一 京都大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (50423059)
笠井 倫志 京都大学, 再生医科学研究所, 助教 (20447949)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 生体膜 / 脂質ラフト / 人工膜 / ロドプシン / 受容体 / GPCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラフト領域と非ラフト領域が明確に分かれたパターン化人工膜を用いて、膜タンパク質のラフト親和性および機能を定量的に測定する技術を開発するため、平成26年度は、（１）パターン化人工膜の作製、（２）パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成を行った。
DiynePCを光リソグラフィー技術で局所的に重合したパターン化脂質膜は、紫外光照射量を調節することで、ポリマー脂質膜と流動性脂質膜とが数十ナノメートルのドメインとして混在する部分重合領域を形成することができる。3種類の脂質（DOPC/DPPC/Chol）の混合脂質膜を導入すると、部分重合膜領域（R1）でより強いTR-PE蛍光が観察された。TR-PEは非ラフト膜領域（Ld相）に局在することが知られており、ラフト膜領域（Lo相）が流動性脂質膜（R0）に濃縮し、非ラフト膜領域（Ld相）が部分重合膜（R1）に濃縮するという、パターン化相分離が確認され、TR-PE蛍光値からLo相、Ld相の分布を定量することが可能になった。
膜タンパク質再構成の検討は、ロドプシン光受容体（Rh）およびトランスデューシン（Gt)を用いて行った。ラフト膜領域（Lo相）と非ラフト膜領域（Ld相）が相分離したパターン化脂質膜に、RhおよびGtを再構成し、両者のLo相、Ld相への分配、拡散速度を測定した。Rhは7回膜貫通型タンパク質であるが、セルの形態、タンパク質・脂質・界面活性剤の濃度などの実験条件を最適化することで、Rh分子の凝集を防ぎ膜に再構成することができた。RhがLo相とLd相の間を自由拡散していることが観察された。Rh、Gtは、TR-PEと同様に非ラフト膜領域（Ld相）への強い局在性を示した。これは、従来の生化学的手法による分離結果と一致しており、パターン化人工膜を用いたラフト親和性が有効であることを示唆する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の一種であるロドプシン（Rh)を、パターン化人工膜に再構成して、拡散速度、機能、Lo/Ld相への分配を定量することに成功した。一般に基板表面に吸着した脂質膜に膜貫通型タンパク質を組み込むことは難しいとされる。従って、GPCRの一種であるRhを、側方拡散、機能を保持してパターン化脂質膜に組み込めたことは大きな成果であると言える。また、Gタンパク質（トランスデューシン）についても、再構成、Lo/Ld相への分配定量に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
RhとGtについては、非ラフト領域に強く局在することが示された。今後は、ラフト領域に局在することがこれまでの生化学実験より示唆されているGPIアンカー型タンパク質を用いて、パターン化人工膜での分配を検討し、パターン化人工膜を用いたラフト親和性解析技術をより確実なものにする。また、代表的なGPCRであるアドレナリン受容体を用いて、ラフト親和性評価を行い、ラフトとGPCR機能との相関について知見を得ることを試みる。
Rhについては、多量体（ダイマー、オリゴマー）やRh-Gt複合体のラフト親和性を検証することが、今後の重要な課題である。そのためには、多量体や複合体が形成されるために十分な高濃度のRh、Gt分子を膜に再構成する必要がある。高濃度なRhを拡散性、機能を保持したまま再構成する手法を、今後開発する予定である。
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| Causes of Carryover |
ロドプシン光受容体の人工膜への導入実験で、一部の検討を引き続き行う必要があるため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ロドプシン光受容体の人工膜への導入実験において、蛍光色素、界面活性剤などの購入に充てる。
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