2016 Fiscal Year Annual Research Report
The molecular mechanism underlying the epithelial barrier formation by tricellular tight junctions
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26291043
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
古瀬 幹夫 生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 教授 (90281089)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
泉 裕士 生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 准教授 (10373268)
菅原 太一 生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 助教 (30758412)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アンギュリン / トリセルリン / タイトジャンクション / 上皮バリア機能 / MDCK細胞 / トリセルラージャンクション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに作製していたアンギュリン1ノックアウトEpH4細胞と親株のEpH4細胞の上皮バリア機能を解析したが、クローンごとのばらつきが大きく、信頼できるデータを取ることができなかった。理由としてEpH4細胞のクローン性が不安定であることが推測された。そこで、用いる細胞をクローディン2をゲノム編集によりあらかじめ欠失させて経上皮電気抵抗値を増加させたMDCKII細胞に変更し、CRISR/Casシステムによりアンギュリン1を欠失させた細胞株を複数クローン取得した。解析の結果、この細胞では、全てのクローンにおいてコントロールと比較して経上皮電気抵抗値が大きく減少するとともに分子量450の可溶性トレーサーの著しい透過が観察された。
この細胞で機能解析を進めるために、まず、MDCKII細胞のトリセルラータイトジャンクション（tTJ)におけるタイトジャンクション構成分子の局在を詳細に調べたところ、オクルディン、クローディンファミリーがアンギュリン1、トリセルリンとともに基底膜方向に伸長していることが確認された。一方、アンギュリン1を欠失させたMDCKII細胞では、この伸長が見られず、tTJの形成が阻害されていることが示唆された。アンギュリン1欠失MDCKII細胞にアンギュリン1を再発現させると、tTJ構成分子、TJ構成分子の基底膜側への伸長が再現されたが、興味深いことに、PDZドメイン結合領域と推測されるLSRのC末端を削ったアンギュリン1変異分子をアンギュリン1欠失MDCKII細胞に再発現させたところ、この基底膜側への伸長は見られなかった。さらに、アンギュリン1のC末端にタイトジャンクションの裏打ちタンパク質ZO-1が結合することを見出し、アンギュリンと裏打ちタンパク質の相互作用が正常なtTJ形成に重要であることが明らかとなった。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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